Remaniement du métabolisme carboné central microbien pour une conversion des sucres lignocellulosiques en acide glycolique avec une conservation optimale du carbone - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2018

Remodelling of microbial central carbon metabolism to convert lignocellulosic sugars into glycolic acid with optimal carbon conservation

Remaniement du métabolisme carboné central microbien pour une conversion des sucres lignocellulosiques en acide glycolique avec une conservation optimale du carbone

Résumé

On an industrial scale, glycolic acid is produced from formaldehyde of which, due to its high toxicity, no traces are allowed in the end products destined for medical or cosmetic applications. Because of this reason, amongst others, its production by microbial fermentation of renewable carbon sources is of great industrial interest. Lignocellose is the most abundant, renewable carbon source on this planet and its hydrolysis yields mainly hexoses (i.e.D-glucose) and pentoses (i.e.D-xylose,L-arabinose). Hence, the existing microbial processes for the valorization of lignocellulose by the production of glycolic acid require the combination of metabolic pathways, optimised for the assimilation of pentoses and hexoses. Following the principles of metabolic engineering, production yields have been maximized by the combining an increased flux towards the production of glycolic acid with a reduction of by-product formation. Surprisingly, none of these studies consider the significant loss of carbon via the production of CO2. The here-proposed novel metabolic pathway distinguishes itself from the existing processes by its capacity to convert all lignocellulosic sugars whilst reducing CO2 emissions. The development and evaluation of two such approaches is presented in this PhD. The first approach uses the synthetic ‘xylulose-1-P’ (Xu1P) pathway for the conversion of D-glucose to glycolic acid (Alkim et al., 2015, 2016; Cam et al., 2016). The pentoses (C5) and hexoses (C6) are naturally converted by E. coli into D-xylulose-5P through the pentose phosphate pathway (PP). By expressing a mutase or phosphatase active on D-xylulose-5, the Xu1P pathway is opened up to Dglucose and L-arabinose. To this end, 7 phosphatases and 3 bacterial/yeast mutases have been selected as candidates. The second approach is completely novel and starts from D-ribulose-5P which is, much like D-xylulose-5P, a common metabolite in the C5 and C6 catabolism of E.coli. Three key enzymes have been identified to constitute a new metabolic pathway for the production of glycolic acid from Dribulose-5P and thereby valorize the C5 and C6 sugars. E.coli’s metabolism has been modified to avoid puyruvate decarboxylation and loss of carbon as CO2. The maximal theoretical yield is the highest reported so far with 3 and 2.5 mol of glycolic acid produced per mol of hexoses and pentoses respectively. The feasibility of both approached has been tested by in vitro enzymatic tests and through in vivo functional screening during growth essays. The enzymes’ capacity to redirect the carbon flux towards glycolic acid production could be evaluated by measuring growth. The second approach led to the development and characterization of a strain producing 0.34g/L and 0.4g/L of glycolic acid from Dglucose and D-xylose respectively. Follow-up of the growth, the endo- and exometabolome analysis and carbon mass balancing allowed to identify some bottlenecks which should be adressed by advanced engineering of the host metabolism to obtain a fermentation process in which glycolic acid production and growth are decoupled. Such biotechnological process has the potential to achieve yields superior to those reported for other existing processes and thereby assure an optimal valorization of all lignocellulosic sugars.
L’acide glycolique (AG) est synthétisé à l’échelle industrielle à partir de formaldéhyde toxique dont toute trace est interdite dans les produits cosmétiques et médicaux. Sa production par fermentation microbienne présente un grand intérêt industriel. La lignocellulose est la source de carbone renouvelable la plus abondante sur terre, son hydrolyse libère principalement des hexoses (i.e D-glucose) et des pentoses (i.e D-xylose,L-arabinose). Les procédés microbiens de valorisation de la lignocellulose pour la production d’AG existants requièrent la combinaison de voies métaboliques optimisées pour l’assimilation des pentoses ou des hexoses. Conformément aux principes d’ingénierie métabolique les rendements de ces voies ont été maximisés en augmentant le flux vers l’AG et en réduisant la formation de sous-produits. Étonnement, aucune de ses études ne considère la production de CO2 comme une perte de carbone majeure pour la production. Nous proposons de développer une nouvelle voie métabolique cyclique qui se démarque des procédés existants par sa capacité à convertir l’ensemble des sucres lignocellulosiques, avec la volonté de réduire l’émission de CO2. Cette thèse présente la conception et l’évaluation de deux approches répondant à cet objectif. La première approche repose sur l’utilisation de la voie synthétique ‘xylulose-1P’ (Xu1P) de conversion du D-xylose en AG (Alkim et al., 2015, 2016; Cam et al., 2016). Les pentoses (C5) et hexoses (C6) sont naturellement convertis dans E. coli en D-xylulose-5P (Xu5P) par la voie des pentoses phosphate (PP). L’expression d’une mutase ou phosphatase active sur le Xu5P rendrait la voie Xu1P accessible au D-glucose et L-arabinose. 7 phosphatases et 3 mutases bactériennes et levuriennes candidates ont été sélectionnées à cet effet. La deuxième approche présentée est entièrement originale. Le D-ribulose-5P (Ribu5P) est un métabolite commun au catabolisme des C5 et C6 dans E.coli , au même titre que le Xu5P. Nous avons identifié trois enzymes clefs ayant le potentiel de former une nouvelle voie de production d’AG à partir de Ru5P et ainsi valoriser les C5 et C6. Le métabolisme d’E.coli a été remanié pour s’affranchir de l’étape de décarboxylation du pyruvate et limiter la perte de carbone sous forme de CO2. Le rendement théorique maximal est de 3 mol d’AG par mol d’hexoses et 2,5 mol d’AG par mol de pentoses, il s’agit des plus hauts rendements rapportés à ce jour. L’évaluation de la faisabilité de ces deux approches a été réalisée sur la base de tests enzymatiques in vitro et de screening fonctionnels in vivo par test de croissance. La mesure de la croissance permet dans ce cas d’apprécier la capacité des enzymes étudiées à rediriger le flux de carbone vers l’AG. La deuxième approche a conduit à la conception d’une souche productrice qui a été caractérisée, nous avons démontré la production d’AG à partir de D-glucose (0,34 g/l) et D-xylose (0,4 g/L). Les suivis de croissance, l’analyse de l’endométabolome et de l’exométabolome et la réalisation d’un bilan carbone ont permis d’identifier les éléments limitants. Ces connaissances sont essentielles au développement d’un procédé de production d’AG valorisant de façon optimale l’ensemble des sucres lignocellulosiques
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Dates et versions

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  • HAL Id : tel-04513334 , version 1

Citer

Clea Lachaux. Remaniement du métabolisme carboné central microbien pour une conversion des sucres lignocellulosiques en acide glycolique avec une conservation optimale du carbone. Sciences agricoles. Institut National Polytechnique de Toulouse - INPT, 2018. Français. ⟨NNT : 2018INPT0083⟩. ⟨tel-04513334⟩
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