New insights into assembly dynamics of the axoneme in Trypanosoma brucei - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

New insights into assembly dynamics of the axoneme in Trypanosoma brucei

Mécanismes qui régissent le contrôle de la longueur du flagelle chez Trypanosoma brucei

Résumé

Flagella, also called cilia, are complex organelles that play important roles in motility, sensory recognition and cell morphogenesis. One active field of research is the quest for mechanisms that govern the control of flagellum length. The project aims at investigating this process in the protozoan parasite Trypanosoma brucei, used here as a model organism. While progressing through the different stages of the complex life cycle the length of the flagellum varies greatly between the different stages (3 – 30μm) (reviewed in Rotureau and Van Den Abbeele 2013). In the same cell, T. brucei assembles a new flagellum alongside a mature one, in which further assembly is prevented. The new flagellum is elongated to ~80% of the length of the mature flagellum. The cells then divide and the new flagellum is constructed to full length after division. Our group proposed a model where mature flagella are locked after construction to full length, by an event that takes place before cell division (Bertiaux et al. 2018). In a recent collaboration, a promising gene candidate for this locking event has been described (Atkins et al. 2021), however, the mechanism remains unknown. To investigate the control of axoneme length, we developed a system for the inducible expression of tagged alpha-tubulin. Due to its reliance on sequence integrity and post-translational modifications N- or C-terminally tagged tubulin does not get incorporated into the axoneme of T.brucei. We therefore had to adopt a new approach that has been successfully carried out in yeast and mammalian cells (Sirajuddin et al.) by tagging alpha-tubulin inside the gene instead of a tag on the termini. We first demonstrated that an intragenic Ty1-tag inside the “acetylation loop” results in the incorporation of tagged tubulin similar to endogenous alpha-tubulin. The tagged tubulin was then placed under the regulation of a tetracycline operator to make the expression inducible upon the addition of tetracycline. Whit this system we showed that tubulin is indeed only assembled into the new but not the old flagellum, a pattern that formally demonstrates the locking model proposed by our group (Bertiaux et al. 2018) and (details and figures can be found in the first committee report). Next, we demonstrated that trypanosomes commit to locking their flagella before cell division with a set of experiments utilizing teniposide. A drug that inhibits cell division of trypanosomes but does not temper with basal body segregation, therefore, allowing normal assembly of new flagella. These experiments showed that cells that no longer divide and have two full length flagella do not incorporate new tubulin, which formally proves the cells commitment to locking their flagella before cell division (second committee report). Next, we investigated how new flagella are finished after cell division. One hypothesis postulates that new flagella are finished over several cell cycles after they divided (Farr and Gull 2007). To get an idea on how flagella are remodeled over longer periods of time we performed de-induction experiments where tetracycline was washed out after prolonged initial induction. Together with the data from induction experiments (6-9h) we can confirm this hypothesis and postulate that this post-division-elongation happens during G1-phase. We also tested the locking mechanism in the life cycle stage that is present in the bloodstream of mammals and can claim that it is present there as well.
Les flagelles, également appelés cils, sont des organites complexes qui jouent un rôle important dans la motilité, la reconnaissance sensorielle et la morphogenèse cellulaire. La recherche des mécanismes qui régissent le contrôle de la longueur des flagelles est un domaine de recherche actif. Le projet vise à étudier ce processus chez le parasite protozoaire Trypanosoma brucei, utilisé ici comme organisme modèle. Tout en progressant à travers les différentes étapes du cycle de vie complexe, la longueur du flagelle varie fortement entre les différents stades. Dans la même cellule, T. brucei assemble un nouveau flagelle à côté d'un flagelle mature, dans lequel la poursuite de l'assemblage est empêchée. Le nouveau flagelle s'allonge jusqu'à atteindre ~80% de la longueur du flagelle mature. Les cellules se divisent ensuite et le nouveau flagelle est construit à pleine longueur après la division. Notre groupe a proposé un modèle où les flagelles matures sont verrouillés après leur construction à pleine longueur, par un événement qui a lieu avant la division cellulaire . Dans une collaboration récente, un gène candidat prometteur pour cet événement de verrouillage a été décrit , cependant, le mécanisme reste inconnu. Pour étudier le contrôle de la longueur des axonèmes, nous avons développé un système d'expression inductible de l'alpha-tubuline marquée. En raison de sa dépendance à l'intégrité de la séquence et aux modifications post-traductionnelles, la tubuline marquée en N- ou C-terminal n'est pas incorporée dans l'axonème de T.brucei. Nous avons donc dû adopter une nouvelle approche qui a été réalisée avec succès chez la levure et les cellules de mammifères en marquant l'alpha-tubuline à l'intérieur du gène au lieu d'un marquage sur les extrémités. Nous avons d'abord démontré qu'un tag Ty1 intragénique à l'intérieur de la "boucle d'acétylation" entraîne l'incorporation d'une tubuline marquée similaire à l'alpha-tubuline endogène. La tubuline marquée a ensuite été placée sous la régulation d'un opérateur tétracycline pour rendre l'expression inductible à l'ajout de tétracycline. Avec ce système, nous avons montré que la tubuline n'est en effet assemblée que dans le nouveau mais pas dans l'ancien flagelle, un schéma qui démontre formellement le modèle de verrouillage proposé par notre groupe (Bertiaux et al. 2018) et (les détails et les figures peuvent être trouvés dans le rapport du premier comité). Ensuite, nous avons démontré que les trypanosomes s'engagent à verrouiller leurs flagelles avant la division cellulaire avec une série d'expériences utilisant le téniposide. Ce médicament inhibe la division cellulaire des trypanosomes mais ne perturbe pas la ségrégation des corps basaux, permettant ainsi l'assemblage normal de nouveaux flagelles. Ces expériences ont montré que les cellules qui ne se divisent plus et qui ont deux flagelles complets n'incorporent pas de nouvelle tubuline, ce qui prouve formellement l'engagement des cellules à verrouiller leurs flagelles avant la division cellulaire (rapport de la deuxième commission). Ensuite, nous avons étudié comment les nouveaux flagelles sont terminés après la division cellulaire. Une hypothèse postule que les nouveaux flagelles sont terminés sur plusieurs cycles cellulaires après leur division (Farr et Gull 2007). Pour avoir une idée de la façon dont les flagelles sont remodelés sur des périodes plus longues, nous avons réalisé des expériences de désinduction où la tétracycline a été éliminée après une induction initiale prolongée. Avec les données des expériences d'induction (6-9h), nous pouvons confirmer cette hypothèse et postuler que cette élongation post-division se produit pendant la phase G1. Nous avons également testé le mécanisme de verrouillage au stade du cycle de vie qui est présent dans la circulation sanguine des mammifères et nous pouvons affirmer qu'il est également présent à ce stade.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04527357 , version 1 (30-03-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04527357 , version 1

Citer

Daniel Abbühl. New insights into assembly dynamics of the axoneme in Trypanosoma brucei. Microbiology and Parasitology. Sorbonne Université, 2023. English. ⟨NNT : 2023SORUS357⟩. ⟨tel-04527357⟩
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