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Thèse Année : 2022

Study of HIV-1 release dynamics in real-time at the single cell level by Viro-fluidics

Etude du relargage du VIH-1 en temps réel à l'échelle de la cellule unique par la Viro-fluidique

Joelle Eid
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1377789
  • IdRef : 262067188

Résumé

Upon its entry, HIV-1 replicates and produces new viral particles that are released into the extracellular environment. The crucial step of virus release remains poorly understood because it requires the study at the single cell level. Indeed, quantification of viral production from cell populations with very heterogeneous HIV-1 replication kinetics would give approximate results. This is why we have developed a microfluidic approach that allows the study of HIV-1 release dynamics in real-time at the single cell level. In this study, continuous microfluidics was combined to the virology in order to develop a sensitive and reliable technology to visualize and quantify virus production by a single cell. Three types of chips were fabricated: the trapping chip allowed us to determine the physical and biological parameters that ensure single cell trapping (~10 µm) producing VLPs-GFP. The detection chip, whose performance was compared with the Nanoparticle Tracking Analysis technique, proved to be a valuable tool for accurate and reproducible quantification of fluorescent VLPs (~140 nm) at the single particle scale in cell culture supernatants. The multiplex chip, which combines the two previous chips, allowed us to study in real-time the virus release kinetics at the single cell scale. VLPs-GFP producing HeLa and HEK 293 cell lines were used as study models. For the first time, viral production kinetics could be measured with an average of 50 VLPs / cell / h that was validated by the measurement of viruses produced by the same cells grown in culture dish, confirming the reliability and sensitivity of our approach. Interestingly, the release kinetics profile shows a periodic process (period ~4min) that could be explained by the presence of one or more limiting steps in the virion biogenesis mechanism. The new tools developed here provide novel information on the kinetics of HIV-1 salting-out. They can be used or easily adapted for the study of other pathogens or extracellular vesicles.
Le cycle de réplication du VIH-1 débute par l’entrée du virus dans la cellule hôte et s’achève par la libération des particules virales dans le milieu extracellulaire. L’étape cruciale de libération virale reste peu étudiée car elle nécessite une étude à l’échelle de la cellule unique. En effet, la quantification de la production virale réalisée à partir de populations de cellules dont les cinétiques de réplication du VIH-1 sont très hétérogènes, donnerait des résultats approximatifs. C’est pourquoi nous avons développé une approche microfluidique qui permet d’étudier la dynamique du relargage du VIH-1 en temps réel à l’échelle de la cellule unique.Les travaux réalisés durant ma thèse portent sur la combinaison de la virologie et la microfluidique continue afin de développer une technologie sensible et fiable pour visualiser et quantifier la production virale d’une cellule unique en temps réel. Trois types de puces ont été construites. La puce de capture nous a permis de déterminer les paramètres physiques et biologiques pour immobiliser une cellule (~10 µm) unique qui produit des VLP-GFP. La puce de détection, dont la performance a été comparée avec la technique du Nanoparticle Tracking Analysis, s’est avérée un outil précieux pour une quantification précise et reproductible de VLPs fluorescents (~140 nm) à l’échelle de la particule unique dans des surnageants de culture cellulaire. Et enfin, la puce multiplexe, qui couple les deux fonctions (capture de cellules uniques et détection de virus) m’a permis d’étudier la cinétique de relargage virale en temps réel, à l’échelle de la cellule unique. Des lignées HeLa et HEK 293 productrices de VLPs-GFP m’ont servi de modèles d’études. Pour la première fois la cinétique de production virale a pu être mesurée avec en moyenne 50 VLPs / cellule / h. Ce résultat a été validé par la mesure des virus produits par les mêmes cellules cultivées en boite de culture, confirmant la fiabilité et la sensibilité de notre approche. De façon intéressante, le profil de la cinétique du relargage montre un processus périodique (période ~4min) qui pourrait être expliqué par la présence d’une ou de plusieurs étapes limitantes dans le mécanisme de biogenèse des virions. Les nouveaux outils développés ici apportent des informations inédites sur la cinétique du relargage du VIH-1. Ils pourront être utilisés ou facilement adaptés pour l’étude d’autres pathogènes ou des vésicules extracellulaires.

Domaines

Virologie
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04557054 , version 1 (24-04-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04557054 , version 1

Citer

Joelle Eid. Etude du relargage du VIH-1 en temps réel à l'échelle de la cellule unique par la Viro-fluidique. Virologie. Université de Montpellier, 2022. Français. ⟨NNT : 2022UMONT007⟩. ⟨tel-04557054⟩
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