Investigation of the redox signaling involved in the chloroplast biogenesis.
Etude de la signalisation redox impliquée dans la biogenèse du chloroplaste
Résumé
During chloroplast biogenesis, the assembly of the photosynthetic apparatus is under transcriptional regulations occurring in the nucleus and plastids. Yet, the activity of the Plastid-encoded RNA Polymerase (PEP) is coupled to nuclear transcription for the coordinated expression of Photosynthesis-associated-plastid genes (PhAPGs) and Photosynthesis-associated-nuclear genes (PhANGs). The PhAPGs are specifically transcribed by the light-activated PEP complex that comprises four catalytic subunits (α2, β, β′, β″), 12-PEP-associated proteins (PAPs) and fleeting interactors, such as redox-associated proteins. Among the 12 PAPs, PAP4 (FSD2) and PAP9 (FSD3) are Fe-superoxide dismutases found only in chloroplasts and protect the PEP complex from oxidative stress. These proteins are essential for facing the surge in reactive oxygen species (ROS) that occurs during the first photosynthetic reactions. A strategy of PAP8 proximity labelling led to the identification of another pivotal redox protein PRIN2 (Plastid Redox Insensitive 2) previously reported to interact with the thioredoxin PAP10 and the RNA-binding protein CSP41b (Chloroplast Stem-loop binding Protein). All These proteins are essential to the PEP activity as attested by their photosynthetically-deficient mutant phenotypes . . The thesis investigates the superoxide dismutase activity of purified PAP4 and PAP9 proteins. The question of PAP4 and PAP9’s role to be structural or catalytic in the PEP complex was aimed to be answered. The structure of CSP41b was characterised by cryo-EM at 3.4 Å resolution. The study aimed to identify the interactions between PRIN2 and CSP41b by biophysical techniques such as size-exclusion chromatography, isothermal titration calorimetry, mass spectrometry and cryo-EM. This interaction and others were tested in onion epidermal cells using bimolecular fluorescence complementation assay. For the unbiased fishing of PRIN2 interactors, a proximity labelling strategy was designed. The genetic constructions were cloned and tested in transient experiments proving its feasability. The study presented here is part of a broader project that aims to highlight the functional innovations around plastid transcription specific to Angiosperms.
Au cours de la biogenèse des chloroplastes, l'assemblage de l'appareil photosynthétique est soumis à des régulations transcriptionnelles se produisant dans le noyau et les plastes. Pourtant, l’activité de l’ARN polymérase (PEP) codée par les plastes est couplée à la transcription nucléaire pour l’expression coordonnée des gènes des plastes associés à la photosynthèse (PhAPG) et des gènes nucléaires associés à la photosynthèse (PhANG). Les PhAPG sont spécifiquement transcrits par le complexe PEP activé par la lumière qui comprend quatre sous-unités catalytiques (α2, β, β', β″), des protéines associées au 12-PEP (PAP) et des interactions éphémères, telles que les protéines associées au rédox. Parmi les 12 PAP, PAP4 (FSD2) et PAP9 (FSD3) sont des Fe-superoxyde dismutases présentes uniquement dans les chloroplastes et protègent le complexe PEP du stress oxydatif. Ces protéines sont essentielles pour faire face à l’augmentation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui se produit lors des premières réactions photosynthétiques. Une stratégie de marquage de proximité PAP8 a conduit à l'identification d'une autre protéine rédox pivot PRIN2 (Plastid Redox Insensitive 2) signalée précédemment comme interagissant avec la thiorédoxine PAP10 et la protéine de liaison à l'ARN CSP41b (Protéine de liaison à tige-boucle de chloroplaste). Toutes ces protéines sont essentielles à l'activité de la PEP, comme en témoignent leurs phénotypes mutants photosynthétiquement déficients. . La thèse étudie l'activité superoxyde dismutase des protéines PAP4 et PAP9 purifiées. Il s’agissait de répondre à la question du rôle structurel ou catalytique des PAP4 et PAP9 dans le complexe PEP. La structure de CSP41b a été caractérisée par cryo-EM à une résolution de 3,4 Å. L'étude visait à identifier les interactions entre PRIN2 et CSP41b par des techniques biophysiques telles que la chromatographie d'exclusion de taille, la calorimétrie par titrage isotherme, la spectrométrie de masse et la cryo-EM. Cette interaction et d’autres ont été testées dans des cellules épidermiques d’oignon à l’aide d’un test de complémentation par fluorescence bimoléculaire. Pour la pêche impartiale des Interacteurs PRIN2, une stratégie d'étiquetage de proximité a été conçue. Les constructions génétiques ont été clonées et testées dans des expériences transitoires prouvant leur faisabilité. L’étude présentée ici s’inscrit dans un projet plus large visant à mettre en évidence les innovations fonctionnelles autour de la transcription plastidienne spécifique aux Angiospermes.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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