The lysine methyltransferase SETDB1 regulates mitosis through K84 lysine methylation of INCENP protein
La lysine méthyltransférase SETDB1 régule la mitose via la méthylation de la lysine K84 de la protéine INCENP
Résumé
SETDB1 is a lysine methyltransferase (KMT) of the SUV39 family (Suv39h1, G9a, GLP, SETDB1), which methylates lysine 9 of histone H3 (H3K9), a modification mainly involved in gene repression. Dysregulation of these enzymes has been associated with tumorigenesis, in particular through its action on tumor suppressor genes, thus controlling cell growth, invasion and migration. Beyond histones, all members of the SUV39 family methylate many non-histone substrates, including UBF, p53, DNMT1, HP1, AKT and p63, involved in tumorigenesis. Unlike other KMTs, which are nuclear, SETDB1 is primarily localized in the cytoplasm in several cell types, where SETDB1 is enzymatically active. My project aimed to identify new non-histone substrates and/or cytoplasmic partners of SETDB1 in fibroblasts and embryonic stem cells. For this, we used both a PTM Scan approach (against lysine) coupled with SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture), and MBT pull-down (enrichment of methylated proteins and their partners at the using L3MBTL1 protein coupled to mass spectrometry or MS), as well as TAP-tag analyzes coupled to MS. These approaches have allowed us to identify non-histone proteins, potential targets of SETDB1, mainly involved in cell cycle and mitotic progression, transcription and translation. My main project then focused on the study of non-histone substrates of SETDB1 involved in chromosome condensation and segregation. Our global approaches have identified members of the CPC (Chromosome Passenger Complex), Condensin II and Cohesin complexes as potential targets of SETDB1. I focused on the characterization of INCENP, a subunit of the CPC complex. I showed that INCENP and SETDB1 interact and that SETDB1 methylates lysine 84 of INCENP in vitro. I carried out functional studies in order to characterize the biological role of K84 using a K84R mutant (arginine instead of lysine 84). I found that transient overexpression of this mutant in NIH3T3 cells has a dominant negative and deleterious effect. I constructed stable cell lines of NIH3T3 expressing the normal or mutant forms of INCENP in an inducible manner. The INCENP K84R lines show particular phenotypes such as binucleated cells, micronuclei and the presence of DNA remaining in the cytoplasmic bridge between the daughter cells in cytokinesis. These phenotypes could result from impaired chromosome segregation and defects in mitosis. I continue to analyze these phenotypes and seek to characterize the molecular mechanisms involved. I have established NIH3T3 lines stably expressing histone H2B-GFP and normal or mutant forms of INCENP in an inducible manner. These approaches with cells expressing fluorescent proteins will make it possible to monitor cell division by video-microcopy in order to better characterize the defects in chromosome separation linked to the expression of the INCENP K84R mutant. As for the molecular mechanisms, I analyze by immunoprecipitation the composition of the CPC complex in the presence of the normal or mutant form of INCENP. All of my results should make it possible to characterize the role of SETDB1 in the separation of chromosomes during cell division, which is essential for cell proliferation and plays a key role in cancerous transformation. An article describing my results is in preparation and will be submitted in summer 2022.
SETDB1 est une lysine méthyltransférase (KMT) de la famille SUV39 (Suv39h1, G9a, GLP, SETDB1), qui méthyle la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9), modification principalement impliquée dans la répression génique. Une dérégulation de ces enzymes a été associée à la tumorigenèse, notamment grâce à son action sur les gènes suppresseurs de tumeur, contrôlant ainsi la croissance, l'invasion et la migration cellulaire. Au-delà des histones, tous les membres de la famille SUV39 méthylent de nombreux substrats non histones, dont UBF, p53, DNMT1, HP1, AKT et p63, impliqués dans la tumorigenèse. Contrairement à d'autres KMTs, qui sont nucléaires, SETDB1 est principalement localisée dans le cytoplasme dans plusieurs types cellulaires, où SETDB1 est enzymatiquement active. Mon projet visait à identifier de nouveaux substrats non histones et/ou partenaires cytoplasmiques de SETDB1 dans des fibroblastes et des cellules souches embryonnaires. Pour cela, nous avons utilisé à la fois une approche PTM Scan (contre les lysines) couplée à SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture), et MBT pull-down (enrichissement de protéines méthylées et de leurs partenaires à l'aide de la protéine L3MBTL1 couplée à la spectrométrie de masse ou MS), ainsi que des analyses de TAP-tag couplées à la MS. Ces approches nous ont permis d'identifier des protéines non histones, cibles potentielles de SETDB1, protéines principalement impliquées dans le cycle cellulaire et la progression mitotique, la transcription et la traduction. Mon projet principal s'est ensuite concentré sur l'étude des substrats non histones de SETDB1 impliqués dans la condensation et la ségrégation des chromosomes. Nos approches globales ont permis d'identifier des membres des complexes CPC (Chromosome Passenger Complex), Condensin II et Cohesin comme cibles de SETDB1. Je me suis concentré sur la caractérisation de INCENP, sous unité du complexe CPC. J'ai montré que INCENP et SETDB1 interagissent et que SETDB1 méthyle in vitro la lysine 84 de INCENP. J'ai réalisé des études fonctionnelles afin de caractériser le rôle biologique de K84 en utilisant un mutant K84R (arginine à la place de la lysine 84). J'ai trouvé que la surexpression de ce mutant de façon transitoire dans des cellules NIH3T3 a un effet délétère dominant négatif. J'ai ensuite dû construire des lignées stables de NIH3T3 exprimant les formes normale ou mutante de INCENP de façon inductible. Les lignées INCENP K84R montrent des phénotypes particuliers comme des cellules binucléées, des micronoyaux et la présence d'ADN restant dans le pont cytoplasmique entre les cellules filles en cytokinèse. Ces phénotypes pourraient résulter d'une altération de la ségrégation des chromosomes et de défauts de mitose. Je poursuis l'analyse de ces phénotypes et cherche à caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Actuellement, j'ai établi des lignées stables exprimant l'histone H2B-GFP et les formes normales ou mutantes de INCENP de façon inductible. Ces approches avec des cellules exprimant des protéines fluorescentes permettront de suivre en vidéo-microcopie la division des cellules afin de mieux caractériser les défauts de séparation de chromosomes liés à l'expression du mutant INCENP K84R. Quant aux mécanismes moléculaires, j'analyse par immunoprécipitation la composition du complexe CPC en présence de la forme normale ou mutante de INCENP. L'ensemble de mes résultats doit permettre de caractériser le rôle de SETDB1 dans la séparation des chromosomes lors de la division cellulaire, ce qui est essentiel pour la prolifération cellulaire et joue un rôle clé dans la transformation cancéreuse. Un article décrivant mes résultats est en préparation et sera soumis en été 2022.
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