Development of a biomimetic multitube system for the study of ADPKD - TEL - Thèses en ligne Access content directly
Theses Year : 2020

Development of a biomimetic multitube system for the study of ADPKD

Développement d’un système multitube biomimétique pour l’étude de l’ADPKD


Combining biology and microfluidics, this ambitious thesis project in the field of organs-on-a-chip aims to develop a kidney-on-a-chip to study a cystic kidney disease, ADPKD (autosomal dominant polycystic kidney disease). Disease modelling is still underdeveloped in the rapidly expanding field of organs-on-a-chip. Based on existing kidneys-on-a-chip, we first developed an adapted microphysiological platform, before reproducing the characteristics of ADPKD. Present in two copies in the body, the kidneys are vital endocrine organs with a number of homeostatic functions that maintain the balance of the internal environment (pH, osmolarity, blood volume, etc.). Among their most important functions, the kidneys regulate the excretion of metabolic waste and chemical substances in the urine, as well as blood pressure. They are composed of functional and structural units, the nephrons, with a highly reproducible geometry. Parallel and tightly packed, the nephrons consist of two parts necessary to form urine: the glomerulus for filtering blood, followed by a tubule divided into segments of different diameters to help transform the primary urine into excreted urine. This tubule is lined with a monolayer of epithelial cells resting on a thin basement membrane composed mainly of laminin and collagen IV. However, some kidney diseases, known as nephropathies, lead to the alteration of the nephrons, which are not regenerated, and result in kidney dysfunction. Among them, the most frequent hereditary kidney disease (incidence 1/1000) in the world is ADPKD or autosomal dominant polycystic kidney disease. In the majority of patients, it is caused by a mutation in the PKD1 (85% of cases) or PKD2 (15% of cases) genes, which code for the proteins polycystin 1 (PC1) and polycystin 2 (PC2) respectively. This disease is mainly characterised by the formation of renal cysts, which are due to the progressive dilation of the tubules, followed by detachment and enlargement of these fluid-filled cell spheres. This pathophysiological process takes place over many years, and specific symptoms are only detected around the age of 40-50 years, when the kidneys are very encysted. The progressive deterioration of the kidneys leads to severe renal failure in about 50% of ADPKD patients, requiring dialysis or transplantation. In this project, we developed a model to study cystogenesis according to the "snowball effect" hypothesis, which states that the formation of a cyst from one tubule, and exerting a certain pressure on adjacent tubules, would lead to the exponential formation of new cysts in the vicinity of the first one, and then to their spread throughout the kidney. In other words, tubules adjacent to existing cysts are more likely to form secondary cysts. We hypothesised that this process is due to the compression of tubules by the growth of cysts, leading to disruptions in signalling pathways involved in mechanotransduction (cell morphology, polarity) and consequent dilation of tubules with the formation of secondary cysts. This is accompanied by the rearrangement of the actin and microtubule cytoskeletons, as well as the remodelling of the extracellular matrix (ECM) and the basement membrane (BM) on which the renal epithelial cells rest. Indeed, the composition of these physical and biochemical supports is crucial for the formation and propagation of the cysts that remodel them. Thus, with the emergence of the field of organ-on-a-chip allowing to reproduce the three-dimensional architecture of different organs and tissues in their microenvironment, in relation to their functions, we have focused on kidneys-on-a-chip. To reproduce the snowball effect and to be able to decipher the mechanisms involved in cystogenesis during ADPKD, our approach consisted in developing a kidney-on-a-chip mimicking the organisation of nephrons and the compressions exerted by the expanding cysts. The different steps leading to its development and to the modelling of ADPKD have been outlined in four chapters. In the first chapter, which constitutes the state of the art, an overview of the anatomy of the kidneys and their physiology was described, focusing on the discovery of their functions before focusing on the different aspects of the most common kidney disease to date, ADPKD. Indeed, in the absence of targeted therapeutic treatments, we have focused on organ-on-chip devices developed to mimic the architecture of individual organs in relation to their functions. Born about ten years ago, the field of organs-on-a-chip has made it possible to reproduce the characteristics of many individual organs, starting with the intestine-on-a-chip which was the first organ-on-a-chip developed. Isolated and autonomous organs were progressively connected with the perspective of recapitulating the organisation of the human body, which led to the development of multiorgan-on-a-chip. Among these different organs, some kidneys-on-a-chip have also been developed, but few of them model a specific kidney disease, such as ADPKD, in an appropriate three-dimensional architecture. This first chapter therefore relates the field of organ-on-a-chip and more particularly the latest technological innovations in the field of kidney-on-a-chip, on which our system is based. Indeed, we have succeeded in developing two functional and innovative microphysiological devices with key renal features. Next, we described the manufacturing steps to design and develop an innovative microphysiological system presenting the architecture of nephrons in chapter II. In order to reproduce the tightly packed organisation of nephrons, a central microchamber was thermoformed in transparent plastic. This open microchamber is surrounded by two connectors on the sides, through which the cells are injected. In this microchamber, circular, micrometric (80 µm), parallel and regularly spaced multitubes of 200 µm or 100 µm were moulded in collagen I, one of the main components of the connective tissue constituting the ECM. However, this system does not promote a controlled and identical flow in each tube and its arrangement does not facilitate bioassays. Nevertheless, the dimensions of these tubes and their proximity have not been replicated in other studies. Furthermore, in addition to being open, small and easy to handle, the chip is made of a material that facilitates microscopic image acquisition. Next, to test the functionality of the chip, we seeded it with MDCK, a wild-type renal cell line. We observed that the cells lined the tubes and then gradually filled them, remaining alive for more than a month in the tubes, without causing significant tubular dilation. Following on from this first approach, and to mimic ADPKD, we seeded these tubes with a cell model of the disease (Pkd1-/-). We observed that these cells showed a reduction in adhesion and an alteration in apico-basal polarity in 2D compared to control cells, and proliferated twice as fast. After this initial characterisation on a flat surface suggesting mechanisms related to cystogenesis, we examined the behaviour of the disease model cells in tubular structures moulded in collagen I and in the absence of flow. On the one hand, we have improved the system by better mimicking the basement membrane to which the ADPKD model kidney epithelial cells must adhere, an aspect often neglected in the growing field of tissue engineering and organ-on-a-chip. However, this physical and mechanical support is necessary to optimise culture conditions and approximate renal physiological conditions. Therefore, we coated the collagen I tubes with laminin, one of the most abundant basement membrane proteins. On the other hand, in the tubes we noticed that both cell types formed a monolayer of cuboidal cells, maintaining themselves at least in the first three weeks. The control cells generate minimal tube deformation, whereas the Pkd1-/- cells induce significant tubular expansion, consistent with the early stages of cyst formation. Tube geometry and intracellular organisation were also examined prior to tube obstruction by the cells. As before, both cell types line the tubes forming a more or less circular lumen. The Pkd1-/- cells deform the tubes to a greater extent while organized as a monolayer, implying that they could exert mechanical stress on the tubes. In contrast, the control cells do not significantly deform the tubes. Furthermore, the reduction of the intertubular spacing to 100 µm favours the interaction between the tubes after their expansion, allowing the study of mechanical and chemical couplings between tubes. Thus, Pkd1-/- cells exhibit cystic behaviour reproducing the early tubular deformations in our multitube system, despite the absence of constant and controlled flow in the tubes. Therefore, this innovative kidney-on-a-chip will provide a model for studying the mechanisms involved in cystogenesis. Subsequently, we will induce tube deformation by applying controlled local mechanical stresses and precise flow.
Alliant biologie et microfluidique, cet ambitieux projet de thèse s’inscrivant dans le domaine des organes-sur-puce a pour objectif le développement d’un rein-sur-puce afin d’étudier une maladie kystique rénale, l’ADPKD (maladie polykystique rénale autosomique dominante). La modélisation de maladies est encore peu développée dans le champ en pleine expansion des organes sur puce. Nous appuyant sur les reins-sur-puce existants, nous avons tout d’abord développé une plateforme microphysiologique adaptée, avant d’y reproduire les caractéristiques de l’ADPKD. Présents en deux exemplaires au sein de l’organisme, les reins sont des organes vitaux endocrines ayant plusieurs fonctions homéostatiques permettant de maintenir l’équilibre du milieu interne (pH, osmolarité, volume sanguin, etc…). Parmi leurs fonctions les plus importantes, les reins régulent l’excrétion de déchets métaboliques et de substances chimiques dans les urines, ainsi que la pression artérielle. Ils sont composés d’unités fonctionnelles et structurelles, les néphrons, présentant une géométrie hautement reproductible. Parallèlement disposés et étroitement empaquetés, les néphrons sont constitués de deux parties nécessaires pour former de l’urine : le glomérule permettant de filtrer le sang, suivi d’un tubule divisé en segments de différents diamètres favorisant la transformation de l’urine primitive en urine excrétée. Ce tubule est tapissé d’une monocouche de cellules épithéliales reposant sur une fine membrane basale principalement composée de laminine et de collagène IV. Néanmoins, certaines maladies rénales dites néphropathies entraînent l’altération des néphrons, qui ne sont pas régénérés, et conduisent à un dysfonctionnement rénal. Parmi elles, la maladie rénale héréditaire la plus fréquente (incidence 1/1000) dans le monde est l’ADPKD ou maladie polykystique rénale autosomique dominante. Chez la majorité des patients, elle est causée par une mutation dans les gènes PKD1 (85% des cas) ou PKD2 (15% des cas) qui codent respectivement les protéines polycystine 1 (PC1) et polycystine 2 (PC2). Cette maladie est principalement caractérisée par la formation de kystes rénaux qui sont dus à la dilatation progressive des tubules, suivie d’un détachement et d’un élargissement de ces sphères cellulaires remplies de liquide. Ce processus pathophysiologique s’étend sur de nombreuses années, et des symptômes spécifiques ne sont détectés qu’aux alentours de 40 à 50 ans, lorsque les reins sont très enkystés. La détérioration progressive des reins entraîne, chez environ 50% des patients atteints d’ADPKD, une insuffisance rénale sévère nécessitant des dialyses ou une transplantation. Dans ce projet, nous avons développé un modèle pour étudier la kystogénèse selon l’hypothèse de l'effet " boule de neige ", qui stipule que la formation d’un kyste à partir d’un tubule, et exerçant une certaine pression sur les tubules adjacents, entraînerait la formation exponentielle de nouveaux kystes à proximité du premier, puis leur propagation dans tout le rein. En d’autres termes, les tubules adjacents aux kystes existants sont davantage susceptibles de former des kystes secondaires. Nous avons émis l'hypothèse que ce processus est dû à la compression des tubules par la croissance des kystes, ce qui entraîne des perturbations des voies de signalisation impliquées dans la mécanotransduction (morphologie cellulaire, polarité) et une dilatation consécutive des tubules s’accompagnant de la formation de kystes secondaires. Ce phénomène s’accompagnerait du réarrangement des cytosquelettes d’actine et de microtubules, ainsi que du remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) et de la membrane basale (MB) sur laquelle reposent les cellules épithéliales rénales. En effet, la composition de ces supports physiques et biochimiques est déterminante pour la formation et la propagation des kystes qui les remodèlent. Ainsi, avec l’émergence du domaine des organes-sur-puce permettant de reproduire l’architecture tri-dimensionnelle de différents organes et tissus dans leur microenvironnement, en lien avec leurs fonctions, nous nous sommes penchés sur les reins-sur-puce. Pour reproduire l'effet boule de neige et pouvoir décrypter les mécanismes impliqués dans la kystogénèse au cours de l’ADPKD, notre approche a consisté à développer un rein-sur-puce mimant l’organisation des néphrons et les compressions exercées par les kystes en expansion. Les différentes étapes ayant conduit à son développement et à la modélisation de l’ADPKD ont été exposées à travers quatre chapitres. Dans le premier chapitre qui constitue l’état de l’art, une vue d’ensemble sur l’anatomie des reins et leur physiologie a été décrite, en s’attardant sur la découverte de leurs fonctions avant de se concentrer sur les différents aspects de la maladie rénale la plus commune à ce jour, l’ADPKD. En effet, en l’absence de traitements thérapeutiques ciblés, nous nous sommes focalisés sur les organes-sur-puce développés afin de mimer l’architecture d’organes individuels en lien avec leurs fonctions. Né il y a une dizaine d’année, le champ des organes sur puce a permis de reproduire individuellement les caractéristiques de nombreux organes, à commencer par l'intestin-sur-puce qui a été le premier organe-sur-puce mis au point. Les organes isolés et autonomes ont été progressivement connectés avec la perspective de récapituler l’organisation du corps humain, ce qui a conduit à l’élaboration des multiorganes-sur-puce. Parmi ces différents organes, quelques reins-sur-puce ont également été développés, mais peu d’entre eux modélisent une maladie rénale spécifique, telle que l’ADPKD, dans une architecture tri-dimensionnelle appropriée. Ce premier chapitre relate donc le domaine des organes-sur-puce et plus particulièrement les dernières innovations technologiques dans le champ des reins-sur-puce, sur lesquels repose notre système. En effet, nous avons réussi à développer deux dispositifs microphysiologiques fonctionnels et innovants présentant des caractéristiques rénales clés. Ensuite, nous avons décrit les étapes de fabrication pour concevoir et développer un système microphysiologique innovant présentant l’architecture des néphrons dans le chapitre II. Afin de reproduire l’organisation empaquetée des néphrons, une microchambre centrale a été thermoformée dans un plastique transparent. Ouverte, cette microchambre est entourée de deux connectiques sur les côtés, par lesquelles les cellules sont injectées. Dans cette microchambre, des multitubes circulaires, micrométriques (80 µm), parallèles et régulièrement espacés de 200 µm ou 100 µm ont été moulés dans du collagène I, l’un des principaux composant du tissu conjonctif constituant la MEC. Toutefois, ce système ne favorise pas un flux contrôlé et identique dans chaque tube et son agencement ne facilite pas les essais biologiques. Néanmoins, les dimensions de ces tubes et leur proximité n’ont pas été reproduites dans d’autres études. Par ailleurs, en plus d’être ouverte, petite et facile à manipuler, la puce est fabriquée dans un matériau favorisant l’acquisition d’images au microscope. Ensuite, pour tester les fonctionnalités de la puce, nous y avons ensemencé des MDCK, une lignée cellulaire rénale sauvage. Nous avons observé que les cellules tapissaient les tubes avant de les remplir progressivement, restant en vie plus d’un mois dans les tubes, sans engendrer de dilatation tubulaire significative. Dans la continuité de cette première approche, et pour mimer l’ADPKD, nous avons ensemencé ces tubes avec un modèle cellulaire de la maladie (Pkd1-/-). Nous avons observé que ces cellules présentaient en 2D une réduction de l’adhérence et une altération de la polarité apico-basale par rapport aux cellules contrôles, et proliféraient deux fois plus vite. Après cette première caractérisation sur surface plane évoquant des mécanismes liés à la kystogénèse, nous avons examiné le comportement des cellules modèle de la maladie dans les structures tubulaires moulés en collagène I et en absence de flux. D’une part, nous avons amélioré le système en mimant au mieux la membrane basale sur laquelle les cellules épithéliales rénales modèles de l’ADPKD doivent adhérer, un aspect souvent négligé dans le domaine en expansion de l’ingénierie tissulaire et des organes-sur-puce. Or, ce support physique et mécanique est nécessaire pour optimiser les conditions de culture et se rapprocher des conditions physiologiques rénales. Par conséquent, nous avons recouvert les tubes en collagène I avec de la laminine, une des protéines les plus abondantes de la membrane basale. D’autre part, dans les tubes, nous avons remarqué que les deux types cellulaires formaient une monocouche de cellules cuboïdales, se maintenant au moins dans les trois premières semaines. Les cellules contrôles génèrent une déformation minimale des tubes, alors que les Pkd1-/- induisent une dilatation tubulaire importante, en accord avec les étapes préliminaires de formation des kystes. La géométrie des tubes et l’organisation intracellulaire ont également été examinées avant l’obstruction des tubes par les cellules. De même que précédemment, les deux types cellulaires tapissent les tubes en formant un lumen plus ou moins circulaire. Les cellules Pkd1-/- déforment davantage les tubes au stade de la monocouche, impliquant qu’elles pourraient exercer une contrainte mécanique sur ces tubes. En revanche, les cellules contrôle ne déforment pas significativement les tubes. En outre, la réduction de l’espacement intertubulaire à 100 µm favorise l’interaction entre les tubes après leur dilatation, permettant l’étude des couplages mécaniques et chimiques inter-tubes. Ainsi, les cellules Pkd1-/- ont un comportement kystique reproduisant les déformations tubulaires précoces au sein de notre système multitube, et ceci, malgré l’absence de flux constant et contrôlé dans les tubes. Par conséquent, ce rein-sur-puce innovant constituera un modèle d’étude des mécanismes impliqués dans la kystogénèse. Par la suite, nous induirons la déformation des tubes en appliquant des contraintes mécaniques locales contrôlés, et un flux précis.
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Sarah Myram. Development of a biomimetic multitube system for the study of ADPKD. Life Sciences [q-bio]. Sorbonne Universite, 2020. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04643279v1⟩
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