Molecular mechanism of GluN3A containing NMDA receptors - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Molecular mechanism of GluN3A containing NMDA receptors

Mécanismes moléculaires des récepteurs NMDA non-conventionnels de type GluN3

Marco de Battista
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1401599
  • IdRef : 279360940

Résumé

NMDA receptors (NMDARs) belong to the tetrameric ionotropic glutamate receptor (iGluRs) family. They exhibit a fundamental role in the excitatory glutamatergic neurotransmission, mediating key processes such as synaptic plasticity by long term potentiation (LTP) and depression (LTD), memory formation, and others. During my PhD project, we investigated the structural correlates of the gating mechanism of unconventional NMDAR containing the GluN3A subunit. This subunit assembles with GluN1 as functional excitatory glycine-gated receptors (eGlyRs) that are insensitive to glutamate. Recent data from our lab and others revealed that eGlyRs are widespread in the adult forebrain where they form a novel signaling modality whereby endogenous glycine controls neuronal excitability, circuit function and behavior. Our current knowledge of the structural determinants for GluN1/GluN3A receptors remain very limited, however. When exposed to glycine, these receptors mediate small and quickly desensitizing currents, contributing to hinder their characterization for many years. Glycine binding these receptors causes a biphasic activation curve, since glycine binding the GluN3A subunits activates the receptor, while glycine binding the GluN1 subunits inhibits it. By taking a structure-function methodological approach (site-directed mutagenesis and 2-electrode voltage clamp recordings in xenopus oocytes), we investigated the role of specific regions of GluN1/GluN3A receptors in the control of their gating mechanism. The results of our work can be divided in three main axes: 1) We developed a methodology to assess GuN1/GluN3A receptors open probability (Po) allowing evaluation of the effect of mutations on the receptor activity. We also characterized the effect of the open channel blocker pentamidine on GluN1/GluN3A receptor activity, alongside several other agents such as zinc, magnesium, echinatin, and D-serine. 2) We created a structural model of GluN1/GluN3A receptors and computed several subunit-subunit contact maps, to determine which sites to target to investigate GluN1/GluN3A function. We aimed at stabilizing specific conformational states by employing several different strategies. We thus attempted to crosslink several interfaces by disulphide bridge formation through cysteine scanning, by employing unnatural amino acids (UAAs) that crosslink upon UV light illumination, or by investigating the role of several domains and loops by performing genetic deletions of large functional portions of the receptors. Unfortunately, we obtained limited success with these approaches. 3) We investigated the role of the putative ligand binding domain (LBD) dimerization interface, that is of critical importance for the gating of all iGluRs but of unknown contribution to GluN1/GluN3A. Thanks to the discovery of large Gain-of-Function (GoF) mutants, we reveal that residues located at the LBD intra-dimer interface are key determinants of the gating behavior, in particular of the low Po of GluN1/GluN3A receptors. Mutants that restore the GluN1/GluN2-like hydrophobicity profile, show greatly increased Po and glycine affinity. Overall, our data suggest that the GluN3A LBD likely contact GluN1 LBD similarly to other NMDARs, albeit weaklier. Glycine-gated GluN1/GluN3A receptors are generating strong interest for their physiological role in brain signaling recently unveiled. Our understanding of their molecular mechanisms remained sparse, however. In the present work, we demonstrated the functional importance of the GluN1-GluN3A LBD intra-dimer interface assembly for the gating of the receptor, highlighting similarities and differences with other iGluRs. We believe that the GoF mutants we characterized offer unique opportunities to further elucidate GluN1/GluN3A receptor gating mechanisms. The molecular tools we validated should be of interest for functional and pharmacological tests in the framework of the physiological and pathological roles of these receptors.
Les récepteurs NMDA (NMDAR) appartiennent à la famille des récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluR). Ils jouent un rôle fondamental dans la neurotransmission glutamatergique excitatrice et dans les processus clés de plasticité synaptique, eux-mêmes critiques pour la formation de la mémoire. Au cours de mon projet de doctorat, nous avons étudié les corrélats structurels du mécanisme de déclenchement du NMDAR non conventionnel contenant la sous-unité GluN3A. Cette sous-unité s'assemble avec GluN1 formant ainsi des récepteurs excitateurs dépendants de la glycine (eGlyR) et insensibles au glutamate. Des données récentes de notre laboratoire et d'autres ont révélé que les eGlyRs sont répandus dans le cerveau antérieur adulte où ils forment une nouvelle forme de signalisation par laquelle la glycine ambiante contrôle l'excitabilité neuronale et certains comportements. Les connaissances actuelles sur les déterminants structuraux des récepteurs GluN1/GluN3A restent cependant très limitées. En présence de glycine ces récepteurs génèrent des courants de faible amplitude et rapidement désensibilisants, ce qui a compliqué leur caractérisation. Les récepteurs GluN1/GluN3A présentent une courbe d'activation biphasique puisque la liaison de la glycine aux sous-unités GluN3A active le récepteur, tandis que la liaison de la glycine aux sous-unités GluN1 les inhibe. En adoptant une approche méthodologique structure-fonction (mutagenèse dirigée et TEVC dans les ovocytes de xénope), nous avons étudié le rôle fonctionnel de régions spécifiques des récepteurs GluN1/GluN3A dans le contrôle de leur mécanisme d’activation. Nous avons ainsi : 1) développé une méthodologie pour évaluer la probabilité d'ouverture (Po) des récepteurs GuN1/GluN3A-WT et mutants. Nous avons également caractérisé l'effet de plusieurs composés : pentamidine, zinc, magnésium, échinatine et D-sérine sur l'activité des récepteurs GluN1/GluN3A. 2) L’analyse de modèles structuraux des récepteurs GluN1/GluN3A a permis de déterminer d’identifier des sites potentiels pour stabiliser des états conformationnels spécifiques. Nous avons tenté de ponter plusieurs interfaces par ponts disulfures et utilisation d’acides aminés non naturels (UAA) photo-réactifs. Nous avons aussi tenté de retirer génétiquement de domaines et boucles du récepteur afin d’en étudier le rôle. Cependant, ces approches ont eu un succès limité. 3) Nous avons ensuite ciblé l'interface de dimérisation du domaine de liaison au ligand (LBD), région d'une importance critique pour l’activation de tous les iGluRs, mais de fonction inconnue chez les récepteurs GluN1/GluN3A. Grâce à la découverte d'un mutant Gain-de-Fonction (GoF), nous démontrons que les résidus situés à l'interface intra-dimère LBD sont des déterminants clés du comportement d’activation, en particulier de la faible Po des récepteurs GluN1/GluN3A. Les mutants qui restaurent le profil d'hydrophobicité de type GluN1/GluN2 présentent une Po et une affinité glycine considérablement accrue (>10 fois). Dans l'ensemble, nos données suggèrent que l’interface de dimérisation des LBD chez GluN1/GluN3A joue un rôle clé dans les processus d’activation du récepteur. Les récepteurs GluN1/GluN3A dépendants de la glycine suscitent un vif intérêt pour leur rôle physiologique dans la signalisation cérébrale qui a été récemment découvert. Dans ce présent travail, nous avons démontré l'importance fonctionnelle de l'assemblage de l’interface intra-dimère GluN1-GluN3A LBD pour l’activation du récepteur, en mettant en évidence des similitudes et des différences avec d'autres iGluRs. Nous pensons que les mutants GdF que nous avons caractérisés offrent des opportunités uniques pour élucider les mécanismes fonctionnels des récepteurs GluN1/GluN3A et leurs rôles physiologiques et pathologiques dans le cerveau. Les outils moléculaires que nous avons validés devraient présenter un intérêt pour de futurs développements pharmacologiques.
Fichier principal
Vignette du fichier
De_Battista_2022_These.pdf (30.42 Mo) Télécharger le fichier
Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04646744 , version 1 (12-07-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04646744 , version 1

Citer

Marco de Battista. Molecular mechanism of GluN3A containing NMDA receptors. Neuroscience. Université Paris sciences et lettres, 2022. English. ⟨NNT : 2022UPSLE061⟩. ⟨tel-04646744⟩
0 Consultations
0 Téléchargements

Partager

Gmail Mastodon Facebook X LinkedIn More