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Thèse Année : 2024

Bacterial microcompartments : from study of shell subunit assembly to the development of tools for the nanotechnologies

Les microcompartiments bactériens : étude de l'assemblage des protéines hexamériques des coques et développement d'outils pour les nanotechnologies

Lucie Barthe
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1404192
  • IdRef : 278904084

Résumé

Bacterial microcompartments (BMC) are protein structures, naturally found in some bacteria in which they act as bioreactor and process specific substrates. For instance, depending on the BMC type, the enzymatic set they encapsulate can fixate atmospheric CO2 or catabolize the ethanolamine, 1,2-propanediol or the choline. The BMC shell is polyhedral and is composed of 3 different subunits, including the BMC-H, a protomer associating as an hexamer which are the main and the most diverse shell subunits, in terms of number of homologs within a single BMC operon. Indeed, genomic surveys indicate an average of 3,5 BMC-H homologs per operon, with some organisms like Clostridium saccharolyticum WM1 coding for up to 15 BMC-H split between 3 BMC types.Although it has long been thought that only homo-hexamers existed, it was recently evidenced that hetero-hexamer formation occurred between BMC-H homologs in 2 different β-carboxysome-expressing bacteria. Indeed, numerous BMC-H homologs share a high sequence identity, notably at the intra-hexamer interfaces. Besides paving the way for possible hetero-hexamer formation beyond the β-carboxysome, inside organisms equipped with one BMC type, these recent studies raise the question of possible cross-interactions between BMC-H coming from multiple BMC types.One objective during my PhD thesis was to examine the occurrence of hetero-hexamers in nature. To this end, the tripartite GFP was adapted to study protein-protein interactions among BMC-H and implemented on the case study of Klebsiella pneumonia 342 BMC-H. Of note, this organism is very interesting because it has in its genome 3 BMC loci, comprising a total of 11 BMC-H homologs. Then, besides allowing to determine whether hetero-hexamers do form aside from the β-CBX, in 3 other BMC types, their study would also bring some answer elements to the question of the cross-interactions between BMC-H arising from different BMC types.A novel method to enhance a pathway catalytic efficiency (other than by classical enzymatic engineering) is gaining more and more interests nowadays: enzyme spatial organization. The idea is that, by putting in close proximity or in an arranged fashion the enzymes from a metabolic pathway, one could increase the efficiency of the pathway, through substrate channelling between the different enzymes, for instance, or enzyme clusterisation.The majority of hexamers formed by the BMC-H have the intrinsic property to self-assemble and form higher-ordered macrostructures (nanotubes, Swiss-rolls, 2D sheets) when recombinantly expressed alone in E. coli. This peculiarity has already been exploited in multiple studies to create a protein scaffold for the immobilization of enzymes. In these proof-of-concepts, a sole BMC-H was used to build the scaffold, which would only permit to immobilized different enzymes in a random fashion.Here, we propose to go further with the idea of spatial organization and aimed to elaborate a protein platform starting from an hetero-hexamer. This hetero-hexamer would be composed by 2 up to 6 different BMC-H with each BMC-H constituting an anchoring point for a future enzymatic domain. With such platform, the spatial organization of the enzymes would be more finely controlled which would further enhance the catalysis efficiency of a metabolic pathway.To meet this goal, de novo designed BMC-H were created by 2 collaborator teams of computational design. I studied them and searched for BMC-H couples that would depict orthogonal intra-hexamer interfaces. Indeed, to be able to control precisely the organization onto the platform, this would require to ensure a specific BMC-H order within the hetero-hexamer and thus, tightly control which BMC-H is adjacent to which one and prevent any other association.
Les microcompartiments bactériens (BMC) sont des structures protéiques naturellement présentes chez certaines bactéries dans lesquelles ils agissent comme des bioréacteurs et métabolisent des substrats spécifiques. Selon le type de BMC, le set d’enzymes encapsulé au sein du BMC peut fixer le CO2 atmosphérique ou cataboliser l’éthanolamine, le 1,2-propanediol ou la choline. La coque polyédrique des BMCs est composée de 3 sous-unités différentes dont les BMC-H, un protomère s’oligomérisant en hexamère, sous-unité principale de la coque des BMCs. Des études génomiques ont estimé une moyenne de 3,5 homologues BMC-H par opéron BMC, avec certains organismes tel que Clostridium saccharolyticum WM1 codant jusqu’à 15 BMC-H, répartis dans 3 opérons BMC différents.Bien qu’il fut longtemps considéré que seuls des homo-hexamères existaient, il fut démontré récemment que des hétéro-hexamères pouvaient également se former entre homologues BMC-H, dans 2 bactéries exprimant le β-carboxysome. En effet, les homologues BMC-H partagent généralement une forte identité de séquence, notamment sur leur interfaces intra-hexamère. Outre ouvrir à la possibilité que des hétéro-hexamères se forment dans des organismes dotés d’un autre type de BMC, ces études récentes ont soulevé la question de potentielles cross-interactions entre BMC-H venant de différents types de BMC, au sein d’un même organisme.Un objectif de ma thèse fut d’examiner la formation d’hétéro-hexamères dans la nature. Pour cela, la tripartite GFP a été adaptée à l’étude des interactions protéines-protéines entre BMC-H et appliquée au cas des BMC-H de Klebsiella pneumoniae 342. Cet organisme est en effet doté de 3 loci codant 3 BMCs de différents types, loci qui comptabilisent un total de 11 homologues BMC-H. Ainsi, en plus de nous permettre de déterminer si des hétéro-hexamères se forment en dehors des BMC-H compris dans le β-carboxysome, leur étude pourrait apporter de premiers éléments de réponse sur la possibilité de cross-interactions entre BMC-H provenant de différents types de BMC.Une nouvelle méthode pour améliorer l’efficacité catalytique d’une voie (autre que par l’ingénierie enzymatique) suscite de plus en plus d’intérêt de nos jours : l’organisation spatiale des enzymes. L’idée est qu’en plaçant à proximité ou de manière arrangée les enzymes d’une voie métabolique, il serait possible d’augmenter l’efficacité de la voie.La majorité des hexamères formés par les BMC-H ont la propriété intrinsèque de s'auto-assembler et de former des macrostructures (nanotubes, Swiss-rolls, feuillets 2D) lorsqu'ils sont exprimés seuls dans E. coli. Cette particularité a déjà été exploitée dans de multiples études pour créer un échafaudage protéique pour l’immobilisation d’enzymes. Dans ces preuves de concept, un seul BMC-H a été utilisé pour construire l'échafaudage, ce qui permettait uniquement d'immobiliser les enzymes de manière aléatoire.Nous proposons ici d'aller plus loin dans l'idée d'organisation spatiale et visons à élaborer une plateforme protéique à partir d'un hétéro-hexamère. Cet hétéro-hexamère serait composé de 2 à 6 BMC-H différents, chaque BMC-H constituant un point d'ancrage pour un futur domaine enzymatique. Avec une telle plateforme, l’organisation spatiale des enzymes serait contrôlée plus finement, ce qui améliorerait encore l’efficacité de la catalyse d’une voie métabolique.Pour atteindre cet objectif, des BMC-H ont été designés de novo par 2 équipes collaboratrices de design computationnel. Je les ai étudiés et ai recherché des couples BMC-H qui présenteraient des interfaces intra-hexamères orthogonales. En effet, pour pouvoir contrôler précisément l'organisation sur la plateforme, cela nécessiterait d'assurer un ordre spécifique des BMC-H au sein de l'hétéro-hexamère et de contrôler étroitement quel BMC-H est adjacent à quel autre et d'empêcher toute autre association.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04660228 , version 1 (23-07-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04660228 , version 1

Citer

Lucie Barthe. Bacterial microcompartments : from study of shell subunit assembly to the development of tools for the nanotechnologies. Microbiology and Parasitology. Université de Toulouse, 2024. English. ⟨NNT : 2024TLSEI002⟩. ⟨tel-04660228⟩
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