Tissue Engineering of the Myotendinous Junction
Ingénierie tissulaire de la jonction myotendineuse
Résumé
This PhD registers within the i-Bio interdisciplinary PhD program which combines the expertise of two laboratories: the Developmental Biology Laboratory (LBD-IBPS), at Sorbonne University and the Biomechanics and Bioengineering laboratory (BMBI) at the Université de Technologie de Compiègne.The myotendinous junction (MTJ) is a key component of the musculoskeletal system, at the interface of muscle and tendon. Forces generated by muscle contractions are transmitted via tendons to the skeleton allowing body movement. Despite MTJ key function, the mechanisms underlying its formation are still understudied and consequently poorly understood. The objective of my PhD was to better understand MTJ development and to take benefit from the current knowledge we have on the development of this interface to engineer an in vitro MTJ model. I developed 2D and 3D in vitro models of the muscle/tendon interface, in static and dynamic conditions using the chicken and quail model where I could single out quail and chicken nuclei independently to their differentiation status.We first started to gain insights on the functional relevance of the myonuclei heterogeneity described in myofibres and at the MTJ during limb development. We evaluated if the lack of native spatial and mechanical environment would differ the molecular and cellular heterogeneity of myofibres in a dish or in paralyzed embryos. We performed 2D co-culture in dish to dissociate the autonomous processes from 3D-spatial environment of tissue development. We evidenced that the tip regionalisation of cellular heterogeneity was lost in a dish and paralysed muscles. We also showed that the molecular signature of MTJ myonuclei was lost in 2D-cultures and paralyzed muscles showing that MTJ formation requires spatial and mechanical input. Finally, we identified tip genes that still maintained their expression in a dish and paralyzed embryo. These genes are involved in myofibrillogenesis and myotube attachment. From these experiments we could demonstrate that the behaviour of regionalized markers in cultured myotubes and paralyzed muscles allows us to deduce whether the muscle tip genes intervene in myotube attachment or MTJ matrix production.The second part was to engineer a 2D model of the muscle / tendon interface on electrospun biomaterials. Co-culture experiments were undertaken using a PCL scaffold with PEG ridges thanks to photolithography to orientate the culture. The impact of local and global topography of the material was assessed on muscle and tendon differentiation, in addition to the formation of a muscle / tendon interface. I designed a novel set of mechanical parameters that takes into account the development of an embryo rather than the response of an adult tissue after mechanical stretching. The impact of mechanical stretching was analyzed on the formation of a muscle / tendon interface.In the last part, I engineered a 3D model of the muscle / tendon interface, using the Flexcell technology, to generate a tube of myoblasts and tendon fibroblasts in a pure collagen type I hydrogel under static tension. The muscle/tendon interface was analyzed with the expression of key MTJ markers and cellular behavior overtime. Additionally, we observed an unexpected self-accumulation of tension and torsion forces within our 3D constructs.This work provides new hints on the molecular and cellular behaviours regulating the formation of the MTJ.
Cette thèse s'inscrit dans le cadre du programme Ibio pour la recherche interdisciplinaire, combinant l'expertise de deux laboratoires : le Laboratoire de Biologie du Développement (LBD-IBPS) de Sorbonne Université et le Laboratoire de BioMécanique et BioIngénierie (BMBI) de l'Université de Technologie de Compiègne.La jonction myotendineuse (MTJ) est un composant majeur du système musculosquelettique, à l'interface du muscle et du tendon. Les forces générées par les contractions musculaires sont transmises par les tendons aux os permettant le déplacement du corps. Bien que son rôle soit défini, les connaissances liées à sa formation sont peu étudiées et par conséquent peu comprises. L'objectif de ma thèse était de mieux comprendre comment cette interface se forme en construisant des modèles in vitro de la jonction. Pour ce faire, j'ai développé des modèles 2D et 3D de l'interface muscle/tendon, dans des conditions statiques et dynamiques à partir de myoblastes de caille et des fibroblastes de poule dont les noyaux respectifs peuvent se distinguer indépendamment de leur statut de différenciation.Nous avons tout d'abord étudié l'importance de l'hétérogénéité des noyaux du fibres musculaires décris dans les membres pendant le développement embryonnaire. Nous avons évalué l'impact des forces mécaniques et d'un environnement 3D sur le maintien de cette hétérogénéité moléculaire et cellulaire en réalisant des expériences de coculture 2D en boîte de culture et des expériences d'immobilisation sur embryon de poule. La culture 2D nous permet de dissocier les processus autonomes de l'environnement 3D de l'embryon. Nous avons mis en évidence que la régionalisation de l'hétérogénéité cellulaire aux extrémités des fibres est perdue en culture et sur embryon paralysé. Nous avons aussi montré que la signature moléculaire des gènes de la jonction sont perdus dans les cultures 2D et dans les embryons immobilisés. Ceci démontre que les forces mécaniques sont nécessaires pour activer l'expression de marqueurs de la jonction. Finalement, nous avons identifié que l'expression des gènes impliqués dans la fabrication des fibres musculaires et dans l'attachement des myotubes est maintenue. De ces expériences, nous pouvons déduire si le gène qui est exprimé intervient dans l'attachement des myotubes ou bien dans la production d'une matrice bénéfique à la formation d'une interface muscle/tendon.Dans un second temps, j'ai pu développer un modèle 2D de l'interface muscle/tendon à partir de biomatériaux électrofilés. Les expériences de cocultures sont réalisées sur des matériaux non tissé de PCL (Poly-e-caprolactone) avec des canaux de PEG (Poly-ethyleneglycol) photolithographiés à la surface du matériau pour orienter la culture cellulaire. L'impact de la topographie locale et globale sur la différenciation musculaire et tendineuse, et sur la formation d'une interface muscle/tendon est étudié. Un protocole de test mécanique tenant compte du développement embryonnaire est également développé et la réponse suite à ce test mécanique sur la formation d'une interface muscle/tendon est évaluée.J'ai finalisé ce projet de thèse par le développement d'une interface muscle/tendon 3D alliant la technologie Flexcell et généré des constructions 3D de myoblastes et fibroblastes dans un hydrogel de collagène pur en condition statique. L'expression des marqueurs de la jonction et le comportement cellulaire (orientation des cellules) est étudié au cours du temps.Ce travail permet d'apporter un nouveau regard sur les comportement moléculaires, cellulaires et physiques régulant la formation de la MTJ.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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