Development of innovative isotopic labelling approaches to characterize by NMR mAbs produced in CHO cells
Développement d'approches innovantes de marquage isotopique pour la caractérisation par RMN d’anticorps monoclonaux produits en cellules CHO
Résumé
Monoclonal antibodies (mAbs) are biotherapeutics products that have achieved outstanding success for the treatment of many life-threatening and chronic diseases. Due to their high therapeutic potential towards the development of new treatments to numerous incurable diseases, mAbs market share are steadily expanding on the drug market. In the pharmaceutical industry, mAbs are mainly produced in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. To ensure that each batch retains full therapeutical activities, it is essential to control the structural quality of mAbs. However, none of the many analytical techniques available nowadays offer a sufficient resolution to provide a structural answer at the atomic scale to the loss of therapeutic potency observed during stress studies. To this end, 2D 1H-13C NMR experiments of methyl groups is a promising technique providing access to a much higher resolution. Indeed, methyl groups are very well distributed throughout the mAbs structure, and their physico-chemical characteristics make them ideal probes for monitoring any structural perturbation of the mAb at an atomic scale using NMR. However, the use of 2D 1H-13C NMR spectra, reflecting the mAbs structure at an atomic scale, is currently limited to the comparison of 'spectral fingerprints' with reference spectra. To go further, and in order to correlate the loss of activity with perturbation observed in NMR spectra, each NMR signal must be assigned to its corresponding methyl group in the mAb. This assignment process requires a stable isotope enrichment (13C, 15N, 2H) of mAbs. However, no isotopic labeling method for proteins produced in CHO cells has been proposed to date.In this context, this work aimed to provide robust isotopic labelling protocols enabling NMR resonances assignment of mAbs methyl groups expressed in CHO cells. To this end, an isotopic labelling method of methyl groups (13CH3) of the anti-LAMP1 antibody expressed in CHO cells has been developed, enabling the acquisition of high-quality 2D 1H-13C NMR experiments of methyl groups. However, protein perdeuteration is impossible in mammalian cells, preventing assignment of 3D NMR signal of the antibody. To overcome this, an isotopic labelling method for the Fab and Fc fragments of the antibody was developed in a cell-free expression system, enabling production of proteins in a perdeuterated solvent (contrary to expression in CHO cells).Thus, uniformly U-[2H,13C,15N]-labelled Fab and Fc fragments were produced for the acquisition of 2D 1H-15N and 3D NMR experiments, enabling for the first time the backbone assignment of 1H-15N NMR resonances of a Fab antibody fragment. Then, a 13CH3 optimized isotopic labelling method, specific to amino acids bearing a methyl group, was also implemented for the deuterated Fab fragment expressed in cell-free system, providing for the first time the resonances assignment of the 1H-13C NMR spectra of methyl groups this same Fab fragment. Overlay of the assigned 1H-13C NMR spectra of the Fab fragment expressed in cell-free system with those of the 13CH3-labelled antibody in CHO cells then enabled to transfer of methyl group assignments of the Fab fragment to the spectrum of the antibody expressed in CHO cells. Paving the way for the use of methyl group NMR for structural and dynamic characterization, this work represents a major advance towards in-depth studies of the interactions and modifications of therapeutic mAbs at the atomic scale resolution.
Les anticorps monoclonaux (mAb) sont des produits bio thérapeutiques ayant apporté de nombreuses solutions pour le traitement de maladies létales ou chroniques. En raison de ce potentiel thérapeutique élévé, le poids des mAbs sur le marché du médicament est en croissance constante. En industrie pharmaceutique, les mAbs sont principalement exprimés en cellules ovariennes de hamster chinois (CHO). Afin de valider l’activité de chaque lot de production, il est impératif de s’assurer de la qualité structurale des mAbs produits. Parmi les nombreuses techniques analytiques utilisées jusqu’à présent, aucune n’offre une résolution suffisante pour apporter une réponse structurale à l’échelle atomique sur les pertes d’activité thérapeutique observées à la suite d’études de stress. Pour cela, la RMN 2D 1H-13C des groupements méthyles, donnant accès à une résolution beaucoup plus élevée, s’avère prometteuse. En effet, les groupements méthyles des anticorps sont distribués uniformément sur la structure des mAbs et leurs caractéristiques physico-chimiques en font des sondes idéales pour suivre par RMN toute perturbation de la structure des mAb à l’échelle atomique. Cependant, l’utilisation de ces spectres RMN 2D 1H-13C, qui reflètent la structure des mAb à l’échelle atomique, est actuellement limitée à la comparaison ‘’d’empreintes spectrales’’ à un spectre de référence. En effet, l’attribution de chaque signal RMN à son groupement méthyle dans le mAb doit être réalisée en amont pour corréler les pertes d’activités observées avec perturbations observéés sur les spectres RMN. Ce processus d’attribution nécessite l’enrichissement en isotopes stables (13C,15N,2H) des mAbs. Cependant, aucune méthode de marquage isotopique pour les protéines produites en cellules CHO n’a été proposée à ce jour.Dans ce contexte, ces travaux de thèse ont eu pour ambition de développer des protocoles robustes de marquages isotopiques permettant l’attribution des résonances RMN des groupements méthyles d’un anticorps exprimé en cellules CHO. Pour cela, une méthode de marquage isotopique des groupements méthyles (13CH3) de l’anticorps anti-LAMP1 exprimé en cellules CHO a été développée permettant ainsi l’acquisition d’expériences RMN 2D 1H-13C des groupements méthyles de haute qualité. Cependant, la perdeutération des protéines, nécessaire à l’attribution des expériences RMN 3D d’un anticorps, est impossible en cellules de mammifères. Pour résoudre ce problème, une méthode de marquage isotopique des fragments Fab et Fc de l’anticorps a été développée en système d’expression acellulaire (Cell-Free). En effet, contrairement aux cellules CHO, l’utilisation de ce système permet la production de protéines en solvant deutéré.Ainsi, les fragments uniformément marqués U-[2H,13C,15N] ont été produits pour l’acquisition d’expériences RMN 2D 1H-15N et 3D, permettant de proposer pour la première fois l’attribution des résonances RMN 1H-15N du squelette d’un fragment Fab d’un anticorps. Puis, une méthode de marquage isotopique optimisée 13CH3 spécifique des acides aminés portant un groupement méthyle a été appliquée sur le fragment Fab perdeutéré et exprimé en système cell-free, permettant ainsi d’attribuer les résonances des spectres RMN 1H-13C des groupements méthyles de ce même fragment Fab. La superposition des spectres RMN 1H-13C attribués du fragment Fab exprimé en système cell-free avec ceux de l’anticorps marqué 13CH3 en cellules CHO a ensuite permis de transférer l’attribution des groupements méthyles du fragment Fab vers le spectre de l’anticorps exprimé en cellules CHO. Ces travaux ouvrent la possibilité d’utiliser la RMN des groupements méthyles pour les caractérisations structurale et dynamique ainsi que pour les études des interactions et des modifications des mAb thérapeutiques à l’échelle atomique.
Domaines
Biologie structurale [q-bio.BM]| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
|---|