Study of the scanning kinetics during translation initiation by single molecule fluorescence microscopy
Etude de la cinétique de scanning lors de l'initiation de la traduction par microscopie de fluorescence en molécule unique
Résumé
Protein synthesis is a complex multistep process involving many factors that need to interact in a coordinated manner to properly translate the messenger RNA. As translating ribosomes cannot be synchronized over many elongation cycles, single-molecule studies have been introduced to bring a deeper understanding of translation dynamics. This approach has been first applied to prokaryotic translation and, recently to eukaryotic systems. In our study, we are interested in a specific step of translation initiation called scanning. During this step, the pre-initiation complex (PIC), which contains the small ribosomal subunit and translation initiation factors, slides on the mRNA 5' toward 3' to localize the start codon. To assemble the PIC on the 5' end of our model mRNA,we use an internal ribosome entry site (IRES) of the EMCV virus. The initiation process starts when the PIC is recruited on the mRNA by the IRES. Than the PIC scans the mRNA downstream the IRES until it reaches the start codon. The objective of this work is to determine the scanning speed and to assess the impact of different secondary structures on the scanning kinetics. To do so, we use a total internal reflexion fluorescent microscopy set-up with single-molecule sensitivity. The major advantage of single-molecule techniques is that there is no need to synchronize the ribosomes to measure their speed. We monitor the passage of individual, unmodified mammalian ribosomes at specific fluorescent milestones along mRNA. These milestones are two fluorescent complementary oligonucleotides (emitting respectively in the green and the red) hybridized at distinct positions of the 5'UTR of the mRNA, and excited alternatively. While scanning, the PIC unwinds the secondary structure and thereby induces the release of the oligonucleotides. This causes the loss of the fluorescence signal from each oligonucleotide. The time lapse between signals due to the release of each oligonucleotide allows a precise assessment of the scanning speed. By using oligonucleotides at complementary to various positions in the 5'UTR we have access to the scanning speed distribution of single ribosomes.
La synthèse des protéines est un processus complexe, multi-étapes impliquant de nombreux facteurs qui doivent interagir de manière coordonnée pour traduire correctement l'ARN messager. Comme les ribosomes en cours de traduction ne peuventpas être synchronisés, des études sur des molécules uniques ont été introduites pour mieux comprendre la dynamique de la traduction. Cette approche a d'abord été appliquée à la traduction chez les procaryotes et, plus récemment, aux systèmes eucaryotes. Dans notre étude, nous nous intéressons à une étape spécifique de l'initiation de la traduction eucaryote appelée "scanning". Au cours de cette étape, le complexe de pré-initiation (PIC), qui contient la petite sous-unité ribosomique et des facteurs d'initiation de la traduction, glisse sur l'ARNm de 5' vers 3' pour localiser le codon START. Pour assembler le PIC à l'extrémité 5' de notre ARNm modèle, nous utilisons un site d'entrée interne du ribosome (IRES) du virus EMCV. Le processus d'initiation commence lorsque le PIC est recruté sur l'ARNm par l'IRES. Ensuite, le PIC parcourt l'ARNm en aval de l'IRES jusqu'à ce qu'il atteigne le codon START. L'objectif de ce travail est de déterminer la vitesse de scanning et d'évaluer l'impact de différentes structures secondaires sur la cinétique de scanning. Pour ce faire, nous utilisons un dispositif de microscopie de fluorescence en réflexion totale en molécule unique. Le principal avantage de travailler à l'échelle de la molécule unique est qu'il n'est pas nécessaire de synchroniser les ribosomes pour mesurer leur vitesse. Nous suivons le passage de ribosomes individuels non modifiés de mammifères via des jalons fluorescents hybridés le long de l'ARNm. Ces jalons sont deux oligonucléotides complémentaires fluorescents (émettant respectivement dans le vert et le rouge) hybridés à des positions distinctes de la région 5'UTR de l'ARNm et excités alternativement. Pendant le scanning, le PIC ouvre la structure secondaire et détache les oligonucléotides. Cela entraîne la perte du signal de fluorescence de chaque oligonucléotide, et l'évaluation précise de la vitesse de scanning. En utilisant des oligonucléotides complémentaires à différentes positions de la région 5'UTR, nous avons accès à la distribution de la vitesse de scanning des ribosomes individuels.
Domaines
Optique [physics.optics]| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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