New insights about LegK4 from Legionella pneumophila
Nouvelles connaissances au sujet de LegK4 de Legionella pneumophila
Résumé
Legionella pneumophila is the bacteria responsible of legionellosis, a severe pneumonia in humans. It is a public health issue due to a 10% mortality rate, even with the proper antibiotic therapy. Pathogenic strains of Legionella emerge from the environment after intracellular multiplication in amoebae. Bacteria can be disseminated by small water particles called aerosols formed by human technologies, such as ornamental fountain. When inhaled, these aerosols allow bacteria to the lower respiratory track where alveolar macrophages are present. To survive phagocytosis, a functional Dot/Icm type 4 secretion system (T4SS) and the secretion of approximately 300 proteins, called effectors, are absolutely required. The objective of this thesis was to contribute to a better understanding of a Legionella effector called LegK4 by combining different experimental approaches. In the first step, we aimed mainly at identifying its localization using ectopic expression of GFP-tagged LegK4 and confocal microscopy. The second part focuses on the identification of LegK4 interactants and substrates using co-immunoprecipitatiton assay, creation of a stable cell-line expressing LegK4, Western-Blot and mass spectrometry. Finally, the third part concerns the LegK4 role and its impact on the infected cells. We aimed to find a different phenotype using competition between fluorescent Legionella with or without legK4 gene. Then, we checked if the phosphorylation activity of LegK4 could impact the host gene transcription. To introduce the context of this work the introduction is composed of four chapters. The first chapter gives important information about Legionella and legionellosis. The second chapter is a review about the major virulence factors of L. pneumophila more particularly the role IV secretion system effectors. Since LegK4 was previously characterized to interact with endoplasmic reticulum chaperone from HSP70 familly and impact the Unfolded Protein Response (UPR), a third chapter is dedicated to these latter. Finally, a last chapter concerns nucleus, epigenetic control and nucleomodulin since this work demonstrated that LegK4 could be nuclear and can modulate host gene transcription.
L. pneumophila, bactérie intracellulaire pathogène appartenant à l’ordre des Legionellales, est l’agent responsable de la légionellose. Cette maladie provoque une pneumonie sévère et est associée à 10% de mortalité, même traitée à temps. L. pneumophila est retrouvée dans les environnements aquatiques associée à des protozoaires, comme les amibes, prédateurs de ces bactéries. Cependant, L. pneumophila a acquis la capacité de survivre et de se répliquer même après phagocytose. A l’intérieur de la cellule qui l’a phagocytée, L. pneumophila est retrouvée dans une vacuole appelée Legionella-containing vacuole (LCV). Au cours de l’infection, L. pneumophila modifie la composition de la LCV afin de la faire ressembler chimiquement à un organite cellulaire et ainsi éviter la lyse. Il a été démontré qu’un des acteurs clé dans la virulence de L. pneumophila est le système de sécrétion de type IV (SST4) qui contribue à la translocation de protéines (ou effecteurs) dans la cellule hôte. Cela permet ainsi à L. pneumophila de contrôler et moduler les différentes voies cellulaires de la cellule qu’elle infecte. Cette thèse a consisté à caractériser l’effecteur LegK4 qui est une sérine/thréonine kinase sécrétée par L. pneumophila 15 minutes après le début de l’infection. La localisation de cet effecteur a été observé au noyau ainsi qu’aux nucléoles. LegK4 migre du cytosol jusqu’au noyau grâce à un signal de localisation nucléaire (NLS). LegK4 est la première kinase bactérienne caractérisée comme étant une nucléomoduline. Un crible double hybride en levure ainsi que des expériences de co-immunoprécipitation (Co-IP), ont permis la mise en évidence de plusieurs interactants et subtrats potentiels de LegK4. La protéine chaperonne BiP (Binding immunoglobulin protein) de la famille de chaperonne HSP70, a été identifié comme cible de LegK4. BiP est impliquée dans de nombreux processus de régulations physiologiques du réticulum endoplasmique comme la réponse au stress du réticulum (UPR). En effet, afin d’augmenter la taille de la LCV, L. pneumophila mobilise et utilise des membranes provenant du réticulum endoplasmique entrainant un stress important. L’UPR permet généralement la résolution du stress du réticulum endoplasmique en ayant un impact fort sur la traduction. L’interaction avec BiP pourrait potentiellement permettre de réduire ce stress et ainsi inhiber l’UPR, évitant l’apoptose de son hôte. En parallèle, il a été montré que l’histone H3 ainsi que d’autres protéines nucléaires interagissaient et étaient phosphorylées par LegK4. La majorité de ces protéines sont impliquées dans du contrôle épigénétique ou dans le cycle cellulaire. Une analyse par spectrométrie de masse a permis de montrer que la majorité des substrats de LegK4 étaient des protéines nucléaires dont la fonction est en lien avec le cycle cellulaire, en particulier la mitose. LegK4 interagissant et phosphorylant l’histone H3, il a été émis comme hypothèse que LegK4 pouvait changer l’expression génique des macrophages grâce à du contrôle épigénétique. Cette hypothèse a été validé grâce à une analyse comparative transcriptomique de macrophages humains infectés par L. pneumophila sauvage versus un mutant isogénique ∆legK4.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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