Characterization of the disease mechanisms underlying clarin-mediated progressive hearing loss
Caractérisation des mécanismes pathologiques sous-tendant la perte auditive progressive médiée par la clarine
Résumé
Despite high prevalence of debilitating hearing loss, underlying mechanisms of progressive hearing loss remain elusive. Our lab has been investigating the role(s) of clarin-1, responsible for Usher syndrome type III, causing progressive hearing loss, and clarin-2, responsible for non-syndromic hearing impairment, in the auditory system. Due to phenotypic variability in Usher Syndrome type III patients, even among patients with the same genetic mutations, we hypothesized that there may be a functional redundancy between the two clarins. Therefore, we generated clarin-1/clarin-2 total and conditional (Bhlhb5-cre and Myo15-cre) knockout mice. Using a multidisciplinary approach, integrating omics and electrophysiological studies with high resolution imaging over time, I pinpointed key molecular pathways dysregulated in the absence of clarin-1 and clarin-2 in auditory hair cells and primary auditory neurons. Phenotypic analysis of Clrn1-/-Clrn2-/- mice revealed profound deafness from hearing onset. Mechanoelectrical transduction (MET) current recordings were absent in Clrn1-/-Clrn2-/- mice, but only reduced in Clrn1-/- and Clrn2-/- mice. These results demonstrate a compensatory functional role of clarin-1 and clarin-2 at the hair bundle. I also observed abnormalities in ionic homeostasis, required for normal MET function and synaptic transmission, that were more severe in Clrn1-/-Clrn2-/- mice, relative to Clrn1-/- and Clrn2-/- mice. These ionic changes were accompanied by pre- and post-synaptic abnormalities, resulting in abnormal cytoplasmic vesicle accumulation and synaptic function in hair cells. Furthermore, I observed a progressive degeneration of the cochlear sensory epithelium and primary auditory neurons over time. To validate the hypothesis that the primary role(s) of clarin-1 and clarin-2 are in hair cells, I studied mice with hair cell-specific (Myo15-cre) deletion of clarin-1 and clarin-2. These conditional clarin knockout mice mimicked the ionic and synaptic changes found in total clarin knockout mice, resulting in primary auditory neuron degeneration. To reinforce this hypothesis, I studied the auditory phenotype in mice with primary auditory neuron-specific (Bhlhb5-cre) deletion of clarin-1 and clarin-2. These mice had normal audition up to 6 months of age, with no cochlear sensory epithelial changes or primary auditory neuron degeneration. To dig deeper into the common and unique molecular functions of clarin-1 and clarin-2, I performed RNA-seq on whole organ of Corti from Clrn1-/-, Clrn2-/-, and Clrn1-/-Clrn2-/- mice. In accordance with physiological observations, I found dysregulation in 8 distinct and physiologically relevant categories: cationic flux, synaptic organization and function, endocytosis and exocytosis, neuronal function and differentiation, metabolic function, actin and cytoskeletal organization, lipid homeostasis, and inflammation. We conclude that clarin-1 and clarin-2 play common and compensatory roles in mechanoelectrical transduction activity and pre- and post-synaptic integrity. The clarins are also required for auditory hair bundle integrity, ion homeostasis in auditory hair cells, and primary auditory neuronal survival. These findings will help elucidate novel mechanisms implicated in progressive hearing loss.
Malgré la forte prévalence de la déficience auditive, les mécanismes sous-jacents de la perte auditive progressive restent inconnus. Notre laboratoire a étudié le(s) rôle(s) de la clarine-1, responsable du syndrome d'Usher de type III, qui entraîne une perte auditive progressive, et de la clarine-2, responsable de la surdité non syndromique, dans le système auditif. En raison de la variabilité phénotypique chez les patients atteints du syndrome d'Usher de type III, même parmi les patients présentant les mêmes mutations génétiques, nous avons émis l'hypothèse qu'il pourrait y avoir une redondance fonctionnelle entre les deux clarines. Nous avons donc généré des souris knock-out totales et conditionnelles (Bhlhb5-cre et Myo15-cre) pour la clarine-1/clarine-2. En utilisant une approche multidisciplinaire, intégrant des études omiques et électrophysiologiques avec une imagerie à haute résolution dans le temps, j'ai identifié les voies moléculaires clés dérégulées en l'absence de clarine-1 et clarine-2 dans les cellules ciliées auditives et les neurones auditifs primaires. L'analyse phénotypique des souris Clrn1-/-Clrn2-/- a révélé une surdité profonde dès l'apparition de l'audition. Les enregistrements de courant de transduction mécano-électrique (MET) étaient absents chez les souris Clrn1-/-Clrn2-/-, mais seulement réduits chez les souris Clrn1-/- et Clrn2-/-. Ces résultats démontrent un rôle fonctionnel compensatoire de la clarine-1 et de la clarine-2 au niveau de la touffe ciliaire. J'ai également observé des anomalies de l'homéostasie ionique, nécessaires au fonctionnement normal de la MET et à la transmission synaptique, qui étaient plus graves chez les souris Clrn1-/-Clrn2-/- que chez les souris Clrn1-/- et Clrn2-/-. Ces changements ioniques s'accompagnent de troubles pré- et postérieurs à l'apparition de la maladie. Pour valider l'hypothèse selon laquelle le(s) rôle(s) principal(aux) de la clarine-1 et de la clarine-2 se situe(nt) dans les cellules ciliées, j'ai étudié des souris chez lesquelles la clarine-1 et la clarine-2 ont été inactivées de manière spécifique dans les cellules ciliées (Myo15-cre). Ces souris knock-out conditionnelles reproduisaient les changements ioniques et synaptiques observés chez les souris knock-out totales pour les clarines, entraînant une dégénérescence des neurones auditifs primaires. Pour renforcer cette hypothèse, j'ai étudié le phénotype auditif chez des souris ayant subi une délétion spécifique des neurones auditifs primaires (Bhlhb5-cre) de la clarine-1 et de la clarine-2. Ces souris avaient une audition normale jusqu'à l'âge de 6 mois, sans modification de l'épithélium sensoriel cochléaire ni de la dégénérescence des neurones auditifs primaires. Afin d'approfondir les fonctions moléculaires communes et uniques de clarine-1 et clarine-2, j'ai effectué une analyse séquentielle de l'ARN sur l'organe de Corti entier de souris Clrn1-/-, Clrn2-/- et Clrn1-/-Clrn2-/-. Conformément aux observations physiologiques, j'ai constaté une dysrégulation dans 8 catégories distinctes et physiologiquement pertinentes : le flux cationique, l’organisation et la fonction synaptique, l’endocytose et l’exocytose, la fonction neuronale et différenciation, la fonction métabolique, l’organisation de l'actine et du cytosquelette, l’homéostasie lipidique et l’inflammation. Nous concluons que la clarine-1 et la clarine-2 jouent des rôles communs et compensatoires dans l'activité de transduction mécano-électrique et dans l'intégrité pré- et post-synaptique. Les clarines sont également nécessaires à l'intégrité de la touffe ciliaire auditive, à l'homéostasie ionique dans les cellules ciliées auditives et à la survie des neurones auditifs primaires. Ces résultats permettront d'élucider de nouveaux mécanismes impliqués dans la perte progressive de l'audition.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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