Hepacivirus / hepatocyte interplay leading to liver metabolic disorders
Étude des interactions entre hépacivirus et hépatocytes conduisant à des perturbations métaboliques du foie
Résumé
Chronic hepatitis C is a progressive liver disease, resulting in metabolic disorders, such as steatosis, an abnormal lipid accumulation in hepatocytes, and long-term complications of cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The prevalence of clinical manifestations varies according to the hepatitis C virus (HCV) genotype (Gt), with Gt3 being highly associated with steatosis. HCV-induced pathologies can be driven by both direct and indirect mechanisms, with virus-driven ones thought to be essentially mediated by two pleiotropic viral proteins, the capsid protein (Core) and a nonstructural protein, NS5A. Core and NS5A are reportedly involved in the deregulation of several host pathways, although mainly studied in transient protein over-expression systems and/or in non-hepatic cells. Moreover, a detailed understanding of the molecular mechanisms involved is hindered by the absence of a fully pertinent study model. A promising surrogate model emerged with the demonstration in 2018 that a new rodent hepacivirus (RHV-rn1) establishes chronic infection in rats, its natural host. This work aimed at elucidating the molecular bases for HCV manipulation of host pathways leading to steatosis and HCC, with a focus on the common and distinct effects of HCV Gts. The first project targeted the identification of cellular interacting partners (IPs) of Core and NS5A and specifically deregulated signaling pathways in a relevant infection system. The second project provided an immunocompetent surrogate animal model to carry out essential pathobiology studies in vivo. We generated a panel of functional recombinant viruses encoding HCV Core or NS5A of Gt1-4 within the backbone of a Gt2a cell culture-adapted strain (Jad). Core and NS5A sequences were selected from clinical isolates of patients with known stages of liver damage or from prototypic HCV strains. In frame twin strep-tag (ST) fusion to Core or NS5A allowed affinity purification of protein complexes from infected human hepatoma Huh-7.5 cells. IPs were identified by liquid nano-chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Strong IPs were discriminated with respect to non-binding V5-tagged controls by a novel scoring algorithm that we developed. Using CytoScape and STRING tools, the highest scored pathways enriched among the 134 IPs of Jad Core were involved in the regulation of host gene expression, while for the 527 Jad NS5A IPs, enrichment highlighted pathways involved in metabolic, transport, immune system and HCC processes. We next unveiled Gt/strain-specific IPs of NS5A, with cholesterol biosynthesis and gluconeogenesis pathways being enriched mainly in the Gt3 NS5A IPs. To further proteomic data obtained on Core, we examined hepatocyte transcriptomic deregulations in response to infection of Huh-7.5 cells with Core intergenotypic recombinant viruses. RNA sequencing analysis demonstrated a high impact of all viruses compared to noninfected cells. Differential regulations by specific strains and/or Gts were observed by gene set enrichment analysis. In parallel, we successfully developed the HCV surrogate animal model based on Sprague Dawley rats infected with RHV-rn1, showing a high rate of chronic infections and liver steatosis. Pilot comparative lipidomic and metabolomic analyses of chronically infected versus non-infected rats revealed perturbed gluconeogenesis, as well as increased cholesteryl ester and free fatty acids in infected livers. In conclusion, in relevant infection systems, we found that Core and NS5A may contribute to the progression of HCV-induced liver damage in a genotype-specific manner, by deregulating the host transcriptome or by directly interacting with proteins involved in specific host pathways, respectively. We also identified hepacivirus-induced metabolic alterations during chronic infection in a surrogate hepacivirus animal model, paving the way for further characterization, including in the presence of host comorbidity factors like western diet.
L'hépatite C chronique est une maladie progressive du foie, entraînant la stéatose, une accumulation anormale de lipides, ainsi qu'une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire (CHC) à long terme. La prévalence de ces manifestations varie selon le génotype (Gt) viral, le Gt3 étant très fortement associé à la stéatose. Ces pathologies sont le résultat de mécanismes à la fois directs, supposés être principalement médiés par les protéines Core et NS5A du virus de l'hépatite C (VHC), et indirects. La compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu souffre de l'absence d'un modèle d'étude pertinent. Un modèle de substitution prometteur a émergé avec la démonstration en 2018 qu'un nouvel hepacivirus de rongeur (RHV-rn1) établit une infection chronique chez le rat. Ce travail visait à élucider les bases moléculaires de la dérégulation des voies hépatocytaires menant à la stéatose et au CHC, notamment les effets communs et différentiels des Gts du VHC. Dans le premier projet, les partenaires cellulaires (IPs) des protéines Core et NS5A et les voies de signalisation dérégulées spécifiquement ont été identifiés dans un système d'infection pertinent. Le deuxième projet a permis de disposer d'un modèle animal immunocompétent, celui des rats Sprague Dawley infectés par le RHV-rn1, pour réaliser des études de physiopathologie in vivo. Nous avons produit un ensemble de virus chimériques dérivés d'une souche adaptée du Gt2a (Jad) codant Core ou NS5A d'isolats de patients de Gt1-4 pour lesquels les données cliniques étaient disponibles, et des recombinants Jad exprimant Core ou NS5A dotées d'un tag twin-strep (ST) à des fins de purification de complexes protéiques à partir de cellules Huh-7.5 d'hépatome humain infectées. Les IPs ont été identifiés par nano-chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Les IPs fortes ont été discriminées par rapport à des contrôles non spécifiques avec un nouvel algorithme que nous avons développé. À l'aide des outils CytoScape et STRING, les voies cellulaires en majorité enrichies parmi les 134 IPs de Core s'avèrent impliquées dans la régulation de l'expression des gènes de l'hôte, tandis que les 527 IPs de NS5A font essentiellement partie des voies impliquées dans les processus métaboliques, le transport, les réponses immunes et le CHC. Nous avons ensuite identifié des IPs de NS5A spécifiques de souche/Gt, les voies de biosynthèse du cholestérol et de gluconéogenèse étant enrichies principalement pour les IPs de NS5A du Gt3. Le séquençage comparé de l'ARN des cellules Huh-7.5 infectées par les différents virus intergénotypiques exprimant Core des Gt1-4 a démontré un impact élevé de tous les virus par rapport aux cellules non infectées. Des dérégulations transcriptomiques différentielles selon les souches/Gts ont été observées par analyse d'enrichissement de gènes. En parallèle, nous avons développé avec succès le modèle animal de substitution du VHC basé sur des rats Sprague Dawley infectés par RHV-rn1, montrant un taux élevé d'infections chroniques et de stéatose hépatique. Des analyses pilotes comparatives lipidomiques et métabolomiques de rats chroniquement infectés par rapport à des rats non infectés ont révélé une gluconéogenèse perturbée, ainsi qu'une augmentation des esters de cholestérol et des acides gras libres dans les foies infectés. En conclusion, dans des systèmes d'infection pertinents, nous avons montré que Core et NS5A du VHC peuvent contribuer à la progression des lésions hépatiques d'une manière spécifique selon le génotype viral, en dérégulant respectivement le transcriptome ou en interagissant directement avec des protéines impliquées dans des voies spécifiques de l'hôte. Nous avons également identifié des altérations métaboliques au cours des infections chroniques à hepacivirus dans un modèle animal de substitution, ouvrant la voie à une caractérisation plus approfondie, y compris en présence de facteurs de comorbidité de l'hôte comme le régime alimentaire.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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