Study of the importance of cell confluence on TRPV4 channel activity in hypoxic condition : input of Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)
Étude de l'importance de la confluence cellulaire sur l’activité des canaux TRPV4 en condition d’hypoxie : apport de la technique de transfert d’énergie en résonance de bioluminescence (BRET)
Résumé
TRPV4 (Transient Receptor Potential Vanilloid 4) is a polymodal channel among stretch-activated channels (SAC). As a non-selective cationic channel permeable to Ca2+ ions, TRPV4 is involved in various pathophysiological phenomena, especially in pulmonary circulation where it contributes to the development of pulmonary hypertension (PH). It has been shown that its activity is increased in cells conditioned to in vitro chronic hypoxia, inducing a dysregulation of Ca2+ homeostasis leading to cell proliferation and migration, which are phenomena involved in PH. Other studies demonstrated that cell confluence modifies membrane rigidity. Thus, cell density at which cells are cultured could be crucial in the modulation of SAC including TRPV4. Thanks to various approaches, we studied the influence of cell confluence on TRPV4 activity modulation in response to hypoxia in HEK293T cells transfected with TRPV4. Indeed, we recorded unitary currents in patch-clamp (cell-attached mode), and measured calcium response thanks to fluorescent probes (Fura-2 LR AM and Fluo-4 AM) after stimulation with GSK1016790A, a TRPV4 selective agonist. We also used a BRET probe (mNeonG-Calflux-nLuc-TRPV4) allowing us to study calcium concentration directly in the nanoenvironment of the channel. We then evaluated TRPV4 localization to membrane with confocal microscopy, cell surface biotinylation and BRET with a probe allowing us to assess plasma membrane localization of TRPV4 (TRPV4-nLuc + mNeonG-CAAX). Our results show that TRPV4 activity in response to hypoxia in vitro exposure (1 % O2 for 48 h) depends on cell confluence. Indeed, at low confluence level, TRPV4 response is increased in hypoxia, whereas at high confluence level, TRPV4 response is strongly inhibited. This diminution of TRPV4 activation can be explained by an internalization of the channel observed in hypoxia at high cell density. Thus, this highlights the importance of cell culture conditions, namely cell confluence, which could modulate physiological responses and bias results obtained during in vitro experimentations.
TRPV4 (Transient Receptor Potential Vanilloid 4) est un canal polymodal faisant partie des canaux mécanosensibles (ou canaux SAC pour Stretch-Activated Channels). En tant que canal cationique non sélectif perméable aux ions Ca2+, TRPV4 est impliqué dans de nombreux phénomènes physiopathologiques, et notamment au niveau de la circulation pulmonaire où il participe au développement de l’hypertension pulmonaire (HTP). De plus, des études antérieures ont montré que son activité est augmentée lorsque les cellules sont cultivées en condition d'hypoxie chronique in vitro, entraînant une dérégulation de l’homéostasie calcique pouvant mener à une prolifération et une migration des cellules, des phénomènes impliqués dans l’HTP. D’autres études ont également mis en évidence que la confluence cellulaire modifie la rigidité membranaire des cellules. Ainsi, la densité cellulaire à laquelle sont cultivées les cellules, pourrait être cruciale dans la modulation des SAC et notamment de TRPV4. Grâce à différentes approches, nous avons donc étudié l’influence de la confluence cellulaire sur la modulation de l’activité de TRPV4 en réponse à l’hypoxie sur des cellules HEK293T transfectées avec TRPV4. Pour cela, nous avons enregistré les courants unitaires grâce à la technique du patch-clamp (configuration cellule attachée) et mesuré les réponses calciques grâce à l'utilisation de sondes fluorescentes (Fura-2-LR AM et Fluo-4 AM) après stimulation des cellules avec du GSK1016790A, un agoniste sélectif de TRPV4. Nous avons également utilisé une construction BRET (sonde mNeonG-Calflux-nLuc-TRVP4) nous permettant d’évaluer la concentration calcique directement dans le nanoenvironnement du canal. Nous avons ensuite vérifié la localisation de TRPV4 à la membrane par imagerie confocale, biotinylation de surface et BRET avec une construction nous permettant d’évaluer la localisation du canal à la membrane plasmique (sonde TRPV4-nLuc + mNeonG-CAAX). Nos résultats montrent que l’activité de TRPV4 lors d'une exposition in vitro à l’hypoxie (1 % O2 pendant 48 h) est modulée par la confluence cellulaire. Ainsi, à faible confluence, l’activité de TRPV4 est augmentée en hypoxie, alors qu’à forte confluence, elle est fortement inhibée. Cette diminution de l’activation de TRPV4 peut s’expliquer par l’internalisation du canal observée en hypoxie à forte densité cellulaire. Ainsi, ces résultats mettent en évidence l’importance des conditions de culture des cellules, notamment la confluence cellulaire, qui pourraient moduler les réponses physiologiques et biaiser les résultats obtenus lors d'expérimentations in vitro.
Domaines
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