Inhibitors of the Raf/MEK/ERK pathway: Synthesis of 4-azaindole derivatives and evaluation of their efficiency through TR-FRET kinase assays
Inhibiteurs de la voie Raf/MEK/ERK : Synthèse de composés à structure 4–azaindolique et évaluation de leur efficacité par la mise au point de tests TR-FRET
Résumé
Considering the implication of the Raf/MEK/ERK pathway deregulation in 30 % of human cancers, we decided to synthesize potential Raf-1 inhibitors. They were synthesized using the original 4-azaindole as the central core. To introduce various types of substituents in C-2 and C-5, we developed two methodologies from the building block N-benzenesulfonyl-5-methoxy-4-azaindole. The first one is the C-2 lithiation followed by the addition of various electrophiles. The second methodology is the C-5 C-arylation or the N-arylation using palladium-catalysed cross-couplings from the C-5 triflate derivative through Suzuki or Buchwald cross coupling reactions, respectively. The two methodologies ended up to the synthesis of two series of compounds. The first one is functionalized in N-1 and C-5 of the 4-azaindole core. The second one is substituated in C-2 and C-5. In order to test the newly synthesized inhibitors as well as the natural inhibitor PEBP, we have developed several tests to measure in vitro the effect of inhibitors on the activity of the complete cascade Raf/MEK/ERK and also on the activities of each individual kinase. The assays were developed by using 2 TR-FRET methods, Lance UltraTM and LanthascreenTM, and were validated with commercially available inhibitors and compare to the radioactive PFBA method. Finally, 30 compounds were evaluated through in vitro Raf-1 assays. By using the facilities offered by the Canceropôle GO platforms, the compounds were also tested on six different tumor cell lines and on the kinases DYRK1A, GSK3 and CDK5. Several compounds displayed encouraging antitumoral activity and one compound was identified as a Raf-1 inhibitor with an IC50 value of 9.8 μM and a selective cytotoxicity activity towards liver tumor cells Huh7 (IC50 = 3 μM).
Afin de corriger la suractivation de la voie de signalisation Raf/MEK/ERK observée dans 30 % des cancers, nous avons choisi d'inhiber la kinase Raf-1. Les inhibiteurs potentiels de Raf-1 ont été conçus avec un cycle central original 4-azaindolique. Pour apporter de la diversité fonctionnelle au niveau des sommets C-2 et C-5 lors de la synthèse, nous avons optimisé deux méthodes à partir du synthon 5-méthoxy-4-azaindole-Nphénylsulfonyle. La première est une réaction de lithiation du sommet C-2 suivie de la condensation de différents électrophiles et la deuxième est la C-arylation ou N-arylation du sommet C-5 à partir du dérivé triflate en 5 via des réactions de couplage pallado-catalysées de type Suzuki et Buchwald, respectivement. Ces deux méthodes ont permis d'aboutir à 2 séries de composés : une première série fonctionnalisée en position N-1 et C-5 du noyau 4-azaindole et une deuxième série substituée en position C-5 et C-2. Pour tester les nouveaux inhibiteurs synthétisés et un inhibiteur naturel appelé PEBP, nous avons mis au point des tests d'activité in vitro sur l'ensemble de la cascade Raf/MEK/ERK et sur chacune des 3 kinases. Les tests ont été développés avec 2 méthodes de TR-FRET, Lance UltraTM et LanthascreenTM, et ont été validés avec des inhibiteurs commerciaux et comparés par rapport à la méthode radioactive PFBA. Au total, 30 produits finaux ont été évalués in vitro sur la kinase Raf-1. Grâce aux plateformes du Cancéropôle GO, les produits ont aussi été testés sur 6 lignées de cellules cancéreuses et sur les kinases du cycle cellulaire DYRK1A, GSK3 et CDK5. Plusieurs molécules ont montré une activité antitumorale encourageante de l'ordre du μM et un composé a été identifié comme inhibiteur de Raf-1 avec une valeur d'IC50 de 9,8 μM et une cytotoxicité sélective vis-à-vis des cellules du foie Huh7 (IC50 = 3 μM).