Environmental stress in the scleractinian coral Pocillopora damicornis: from the experimental model to the identification of functional biomarkers of stress
Stress environnementaux chez le corail scléractiniaire Pocillopora damicornis : du modèle expérimental à l'identification de marqueurs fonctionnels du stress.
Résumé
High biodiversity and productivity, complexity of biotic interactions and trophic networks, wealth and product source, coastal protection are some of the many emblematic characteristics of the coral reef ecosystem. This prodigious diversity is largely due to the particular biology of the principal reef bioconstructors, the hermatypic corals and associated zooxanthellae symbionts. However, over the last decades, most of the reefs have been critically affected by various natural and anthropogenic disturbances which are, at least for some of them, increasing in frequency and intensity in correlation with global climate changes. Among these disturbances, coral bleaching (the loose of zooxanthellae and/or their photosynthetic pigments) and coral diseases have caused high or even massive rates of coral mortality worldwide. Results of the last worldwide coral reefs monitoring programs are particularly alarming and established that 19% of the reefs are completely destroyed, 20% present all symptoms of an imminent threat of collapse, and 20% are at risk for the forthcoming decades. In this context, the objective of this work was to improve our knowledge of enhanced physiological and transcriptomic mechanisms of coral under thermal stress leading to bleaching and bacterial stress. The objective was also to provide strong bases for the use of relevant biomarkers for coral health monitoring and early detection of these disturbances. This work focused on the scleractinian species Pocillopora damicornis, the bacteria Vibrio coralliilyticus, and on the implementation of stress experiments in a controlled but ecologically realistic system. In the first study, P. damicornis colonies were confronted to a gradual water temperature increase (28°C to 32°C) over a 15 days period. mRNAs differentially expressed (between control and thermally stressed conditions) were isolated by subtractive hybridization and the transcription rate of the most promising genes were measured by quantitative-RT-PCR. These approaches revealed 2 candidates that displayed a drastic expression decrease 6 days before the occurrence of the first symptoms of bleaching. RACE-PCR experiments showed that one of them (PdC-Lectin) contains a C-type lectin domain presenting a specificity for recognition and binding of mannose. Immuno-localization experiments have demonstrated that this protein could be the molecular mediator of host/symbionts interaction, which suggest a putative role in the acquisition or the sequestration of symbionts. The second gene (Pdcyst-rich) codes for a protein potentially involved in calcification processes. Its down-regulation could picture a trade-off mechanism leading to calcification failure during thermal stress. In the second study, responses of P. damicornis confronted to its specific pathogen V. coralliilyticus in a virulent (temperature increased) or non-virulent (constant low temperature) state were studied. The infectious process was exained by the combination of electronic microscope observations and quantitative-RT-PCR experiments, and coral health status was evaluated by visual observations and zooxanthellae density measures. Results show that infection only occurs after water temperature was increased. Among several ESTs obtained by subtractive hybridization (between control, bacterially, and thermally plus bacterialy conditions), 6 gene candidates were selected for their putative involvement in the immune response, and their transcription rate was measured by quantitative-RT-PCR all long the kinetics of virulent and non-virulent experiments. Among these genes, 3 belong to the lectin family, 2 code for proteins involved in metal binding and the last one codes for a protease inhibitor. Their expression patterns allowed better understanding the immune response of scleractinian corals as well as the impact of Vibrio on its host. The third publication focus on the characterization of the first antimicrobial peptide (AMP) of scleractinian corals, the damicornin of P. damicornis. Results showed that the damicornin is constituvely transcribed and stocked in an inactive form in ectodermal granular cells. Under immune challenge, damicornin is secreted and activated. Results also showed that after bacterial internalization, Vibrio triggers a down-regulation of the damicornin. In our knowledge this is the first report of the down-regulation of an AMP in a host/Vibrio interaction. Finally, 9 biomarkers of environmental stress were identified and demonstrated to be early regulated, in response of thermal stress for 2 of them, and of bacterial stress for the 7 others. For the last ones, it is possible to differentiate between corals confronted to virulent or non-virulent interaction. After this identification step, a validation stage appears to be necessary. This should focus on the quantification of expression variability of each biomarker at different scales, but also on the definition of an expression baseline, which is essential for biomarkers use for coral health monitoring. This work is particularly promising, and opens perspectives in the field of epigenetic mechanisms involvement in functional adaptation of corals to environmental stress. Another interesting perspective would be the study of the links existing between immunity and symbiosis, which have been put to the fore in the present work by the different involvement of a same gene in both functions (PdC-Lectin). Finally, studying responses of corals to acidic stress would be particularly relevant in the actual context of ocean acidification
Biodiversité élevée, complexité des réseaux trophiques et des interactions biotiques, forte productivité, source de produits et de richesses, protection du littoral ... sont quelques unes des caractéristiques emblématiques des écosystèmes coralliens. Cette prodigieuse diversité est largement liée à la biologie particulière des principaux bioconstructeurs du récif, les coraux hermatypiques et leurs zooxanthelles symbiotiques. Mais depuis quelques décennies, la plupart des récifs sont durement affectés par diverses perturbations d'origine naturelle ou anthropique, dont l'intensité et la fréquence augmentent, en lien avec le changement climatique global pour certaines d'entre elles. Parmi ces perturbations, le blanchissement corallien (perte de zooxanthelles symbiotiques et/ou de leurs pigments photosynthétiques) et les maladies coralliennes ont engendré une mortalité importante, parfois massive, des coraux. Le dernier bilan de l'état de santé des récifs à l'échelle planétaire réalisé en 2008 est particulièrement préoccupant : 19% des récifs sont complètement détruits, 20% présentent tous les symptômes d'une destruction imminente, et 20% sont considérés comme menacés dans les décennies à venir. Dans ce contexte, l'ambition de ce travail est d'améliorer les connaissances sur les méchanismes physiologiques et transcriptomiques des coraux soumis à des stress thermiques conduisant au blanchissement, et à des stress biotiques d'origine bactérienne. L'objectif est également de fournir des bases solides pour la mise en oeuvre de biomarqueurs pertinents pour le suivi de l'état de santé des coraux et la prédiction précoce des perturbations. Ce travail a porté sur le corail scléractiniaire Pocillopora damicornis et la bactérie Vibrio coralliilyticus, et a mis en oeuvre des expérimentations "écologiquement réalistes" de stress en milieu contrôlé. Dans une première étude, des colonies de P. damicornis ont été confrontées à une montée graduelle de la température (28 à 32°C) sur une période de 15 jours. Les ARNms différentiellement exprimés (entre conditions stressées et non stressées) ont été isolés par hybridation soustractive et les taux de transcription des gènes les plus intéressants ont été quantifiés par RT-PCR-quantitative. Ces approches ont révélé 2 candidats présentant une répression drastique de leur expression 6 jours avant les premiers symptômes visibles du blanchissement. Des expériences de RACE-PCR ont montré que l'un d'entre eux (PdC-Lectin) contient un domaine lectine de type C présentant une spécificité de reconnaissance pour le mannose. Les expériences d'immuno-localisation ont démontré que cette protéine hôte était potentiellement le médiateur moléculaire des interactions hôte/symbiote, suggérant un rôle dans l'acquisition ou la séquestration des symbiotes. Le second gène (Pdcyst-rich) code une protéine potentiellement impliquée dans les mécanismes de calcification. Sa répression pourrait être le reflet d'un mécanisme de type trade off conduisant à l'arrêt de la croissance durant le stress. La seconde étude a examiné les réponses de P. damicornis confronté à son pathogène spécifique V. coralliilyticus, dans un état virulent (augmentation de la température) et non virulent (température stable). Le processus infectieux a été examiné par microscopie électronique et RT-PCR-quantitative alors que l'état général des coraux a été évalué par des observations visuelles et des mesures de la densité en zooxanthelles. Les résultats montrent que l'infection ne s'est développée qu'après augmentation de la témpérature. Au sein de nombreuses EST obtenues par hybridations soustractives, 6 gènes candidats ont été sélectionnés pour leur implication potentielle dans les mécanismes de la réponse immunitaire, et leur expression a été mesurée tout au long des cinétiques d'interactions virulences et avirulentes (RT-PCR-quantitative). Parmi ces gènes, 3 appartiennent à la famille des lectines, 2 codes des protéines fixant des éléments métalliques et le dernier code un inhibiteur de protéase. L'analyse de leurs patterns de transcription a permis de mieux comprendre la réponse immunitaire du corail, mais aussi l'impact du vibrio sur son hôte. Enfin, la dernière étude a spécifiquement porté sur la caractérisation du premier peptide antimicrobien (AMP) de scléractiniaires, la damicronin de P. damicornis. Nos résultats montrent que la damicornin est constitutivement transcrite dans des cellules granulaires de l'ectoderme oral et stockée sous forme inactive dans les granules. Lors d'un stimulus immun, la damicornin est sécrétée et activée. Nos résultats montrent également que la transcription de la damicornin est réprimée par V. coralliilyticus lorsque ce dernier s'installe dans les tissus coralliens, ce qui semble être le premier exemple de répression d'un AMP lors d'une interaction hôte/Vibrio. Finalement ce sont donc 9 biomarqueurs de stress environnementaux qui ont été identifiés, 2 présentent une répression précoce de leur expression lors d'un stress thermique inducteur de blanchissement et 7 répondent à des stress bactériens. Pour ces derniers, selon l'association de biomarqueurs utilisée il est possible de distinguer des coraux confrontés à des interactions de type avirulente ou virulente. Maintenant que ces biomarqueurs sont identifiés, il apparaît nécessaire de passer aux étapes de validations. Ces dernières auront pour but de quantifier la variabilityé d'expression de ces biomarqueurs à différentes échelles, mais aussi de définir une ligne de base, indispensable pour suivre l'état de santé des coraux à l'aide de ces biomarqueurs. Au terme de ce travail, il apparaît particulièrement judicieux de se pencher sur l'implication des mécanismes épigénétiques dans l'adaptation fonctionnelle des coraux en réponse aux stress environnementaux. L'étude des liens entre l'immunité et la symbiose, marquée ici par les implications différentes d'un même gène (PdC-Lectin) dans ces fonctions, nous paraît également une voie de recherche prometteuse. Enfin, il conviendrait d'étudier l'effet d'un stress acide, ce qui serait particulièrement judicieux dans le contexte actuel d'acidification des océans.