STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF NEUTROPHIL NADPH OXIDASE FROM NEUTROPHILES: USE OF MASS SPECTROMETRY TO CHARACTERIZE p47phox CONFORMATIONAL CHANGES UPON ACTIVATION
ANALYSE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE LA NADPH OXYDASE DES NEUTROPHILES : UTILISATION DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE POUR CARACTERISER LES CHANGEMENTS CONFORMATIONNELS DE p47phox LORS DE SON ACTIVATION
Résumé
NADPH oxidase (NOX) is a multienzymatic complex found in many cellular types, responsible for reactive oxygen species (ROS) production. The neutrophilic NOX is composed of two transmembrane proteins (gp91phox and p22phox) that make up the catalytic core and three cytosolic factors (p47phox, p67phox and p40phox). Upon activation, p47phox, undergoes conformational changes that this study attempts to define in order to better understand the regulation of this complex involved in many diseases. In neutrophils, ROS are responsible for phagocyted pathogen destruction. It therefore appears essential to better understand the molecular bases of the NOX activation mechanism to consider its future regulation. This study has identified a number of conformational changes on p47phox by limited proteolysis and Deuterium eXchange coupled to Mass Spectrometry (DXMS). The AIR release, providing better accessibility to the p22phox binding site was confirmed and characterized from both structural and functional points of view, on the entire protein. Furthermore, a novel surface controlling p47phox auto-inhibited state has been discovered. Site-directed mutagenesis within this surface confirmed this hypothesis by identifying two key residues (R162 and D166) responsible for this auto-inhibition and therefore possible future candidates for therapeutic targets. The relative binding properties of these mutants with GST-p22phoxCter and liposomes were investigated using BiacoreTM and pull-down assays, respectively. The identification of these residues provided a better understanding of the p47phox activation mechanism, and in particular of how AIR unmasking leads to PX domain release. Finally, a methodological study showed that plasmepsin 2 from Plasmodium falciparum was a new tool that may improve DXMS.
La NADPH oxydase (NOX) est un complexe multienzymatique responsable de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) que l'on retrouve dans un grand nombre de types cellulaires. La NOX des neutrophiles est composée de deux protéines transmembranaires (gp91phox et p22phox), qui constituent le site catalytique, et de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). Lors de son activation, p47phox subit des changements conformationnels que nous tâchons de définir, afin de mieux comprendre la régulation de ce complexe impliqué dans un grand nombre de pathologies. Dans les neutrophiles, les ROS sont responsables de la destruction de pathogènes phagocytés. Il paraît donc primordial de bien comprendre les bases moléculaires du mécanisme d'activation de la NOX pour envisager sa régulation future. Au cours de ce travail, des changements conformationnels ont été identifiés sur p47phox par protéolyse ménagée et échange H/D couplés à la spectrométrie de masse (DXMS). Le relargage de l'AIR, entraînant une meilleure accessibilité du site d'interaction avec p22phox, a été confirmé et caractérisé d'un point de vue structural et fonctionnel sur protéine entière. De plus, une surface inédite contrôlant l'état autoinhibé a été mise en évidence. La mutagénèse dirigée au sein de cette surface a permis de confirmer cette hypothèse en identifiant deux résidus clés (R162 et D166) responsables de cette autoinhibition et donc susceptibles d'être de futurs candidats de cibles thérapeutiques. Les propriétés d'interactions relatives des divers mutants avec GST-p22phoxCter et des liposomes ont été testées par BiacoreTM et cosédimentation, respectivement. L'identification de ces résidus a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de p47phox, et notamment comment le démasquage de l'AIR phosphorylée entraîne celui du domaine PX. Enfin, une étude méthodologique a montré que la plasmepsine 2 de P. falciparum était un nouvel outil susceptible d'améliorer la résolution du DXMS.