Integration of thrombin-binding aptamers in point-of-care devices for continuous monitoring of thrombin in plasma - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2015

Integration of thrombin-binding aptamers in point-of-care devices for continuous monitoring of thrombin in plasma

Intégration des aptamères liant à la thrombine dans les dispositifs de point de soins pour la surveillance continue de la thrombine dans le plasma

Résumé

Thrombin is the central enzyme in the process of hemostasis, being at the cross-roads of coagulation and platelet reactions. Normally, in vivo concentration of thrombin is rigorously regulated; however, clinically impaired or unregulated thrombin generation predisposes patients either to hemorrhagic or thromboembolic complications, the major causes of mortally in the US and Europe. Monitoring thrombin in real-time is therefore needed to enable rapid and accurate determination of drug administration strategy for patients under vital threat. Aptamers, short single-stranded oligonucleotide ligands, selected for their high affinity and specificity, represent promising candidates as biorecognition elements for new-generation biosensors. Several aptamers have been developed for thrombin sensing. These aptamers are known to bind distinct exosites of thrombin that gives an advantage of building different assays involving simultaneous targeting two different binding sites. The aim of this PhD work therefore is to investigate different solutions for the integration of thrombin-binding aptamers in point-of-care devices for continuous monitoring of thrombin in plasma. First the kinetics of aptamer interaction with thrombin and specificity towards prothrombin and thrombin – inhibitor complexes was rigorously investigated using Surface Plasmon Resonance. These experiments unveiled the complex character of interaction of the HD1 a 15-bp aptamer with thrombin, confirming nonspecific interactions with prothrombin, natural inhibitors of thrombin, serum albumin and some of other plasma proteins, whereas another 29-bp aptamer HD22 proved to be highly affine and specific towards thrombin. On the other hand we explored aptamer integration options. In order to find optimal surface functionalization conditions for aptamers sensing, different supports such as gold, polystyrene, polycarbonate and appropriate protocols were used. We found that the easiest and the most efficient functionalization strategy is grafting thiol-modified aptamers on the gold surface. Furthermore to achieve nanoscale control of functional aptamer density, we showed advantage of ordered immobilization of already DNA-capped nanoparticles and well-characterized on the desired solid support through convective assembly. Aptamer-modified Gold NP-s were also used to validate thrombin detection principle through hydrodynamic assay involving aggregation of NPs in the presence of the thrombin. With this assay, we validated the principle and at the same managed to detect different concentrations of thrombin (5-500 nM) with good precision, study the thermal stability of the aptamers and their complex with thrombin and specificity of aptamers towards thrombin in buffer. In diluted plasma, however aggregation of nanoparticles occurred even in the absence of thrombin, suggesting the presence of nonspecific interactions with aptamers that cannot be controlled or neglected in aggregation assay. We finally proposed a novel approach to increase sensitivity and specificity for thrombin detection based on the engineering of aptadimer structures bearing aptamers HD1and HD22 interconnected with a nucleic acid spacer. This spacer forms a hairpin of 4 to 9 bp, and fluorophore and quencher couple is embedded within hairpin. In the absence of target, the fluorophore remains quenched, whereas upon capturing a target, fluorescent signal is triggered. Since this strategy requires simultaneous targeting of both binding-sites, it provides an efficient solution for improved thrombin detection, by increasing specificity, selectivity and affinity, and decreasing non-specific interactions. Preliminary tests gave promising results in specific detection for thrombin and opened new perspectives for development specific aptamer-based fluosensor both for the surface and the volume measurements.
La thrombine est l’enzyme principale dans le processus d’hémostase, étant impliquée dans la coagulation et les réactions plaquettaires. Les dérèglements de la concentration de thrombine en raison d’un trouble clinique prédisposent les patients à des complications hémorragiques ou thromboemboliques qui sont une cause de mortalité majeure en Europe et aux Etats-Unis. Le suivi en temps réel de la thrombine dans le sang est donc nécessaire pour améliorer le traitement de patients en état critique. Les aptamères, qui sont de courts nucléotides monobrins, sélectionnés pour leur grande affinité et spécificité vers des cibles déterminées, semblent constituer des candidats prometteurs pour la reconnaissance moléculaire dans des biocapteurs de nouvelle génération. Plusieurs aptamères ont été développés pour la détection de la thrombine. L’objectif de ces travaux est l’étude de différentes solutions d’intégration des aptamères dans des dispositifs de diagnostic de type «point of care» (au chevet du patient) pour le suivi en continu de la thrombine dans le plasma. Dans un premier temps, la cinétique d’interaction des aptamères avec la thrombine et leur spécificité vis-à-vis de la prothrombine et des inhibiteurs de la thrombine ont été étudiés rigoureusement par résonance par plasmons de surface (SPR). Ces travaux ont démontré la faible spécificité de l’aptamère HD1, qui un nucléotide de 15 bases, vis-à-vis de la thrombine, et ont confirmé le présence d’interactions non-spécifiques avec la prothrombine, les inhibiteurs naturels de la thrombine, l’albumine de boeuf et d’autres protéines plasmatiques. Inversement, nous avons observé une bonne affinité de l’aptamère HD22 avec la même liste de cible. Parallèlement, nous avons évalué des stratégies d’intégration d’aptamères dans des dispositifs d’analyse. Nous montrons en particulier que la technique le plus simple et le plus efficace de fonctionnalisations de surface par des aptamères est fondée sur le couplage de fonctions thiol sur des surfaces d’or. Le principe de reconnaissance a ensuite été validé par des expériences d’agrégation en régime hydrodynamique. Celles-ci ont montré la possibilité de détecter la thrombine dans des gammes de concentration de 5 à 500nM. Toutefois, dans du plasma, l’agrégation des nanoparticules a été observée en absence de thrombine suggérant la présence d’interactions non spécifiques. Enfin, afin d’augmenter la spécificité de la détection de la thrombine, nous avons proposé une nouvelle approche basée sur l’ingénierie de structures dimères interconnectant HD1 et HD22. Le lien entre ces deux aptamères peut se replier suivant une structure en tête d’épingle, ce qui met à proximité un fluorophore et son absorbeur de fluorescence. En l’absence de cible, le fluorophore est éteint en raison de la proximité l’absorbeur, alors qu’après capture de la cible, le signal de fluorescence est augmenté. Des tests préliminaires ont donné des résultats encourageants pour la détection spécifique de la thrombine, même dans le plasma.
Fichier principal
Vignette du fichier
TRAPAIDZE Ana_.pdf (8.82 Mo) Télécharger le fichier

Dates et versions

tel-01174364 , version 1 (10-07-2015)

Identifiants

  • HAL Id : tel-01174364 , version 1

Citer

Ana Trapaidze. Integration of thrombin-binding aptamers in point-of-care devices for continuous monitoring of thrombin in plasma. Micro and nanotechnologies/Microelectronics. UT3, 2015. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-01174364⟩
334 Consultations
1250 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More