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Thèse Année : 2019

Study of the proteasome PAN-20S mechanism of action by time resolved small angle neutron scattering

Étude du mécanisme d’action du protéasome PAN-20S par diffusion de neutrons aux petits angles résolue en temps

Résumé

Proteasomes are large ubiquitous macromolecular assemblies composed of a 20S catalytic complex and a regulatory particle containing an AAA-ATPase module. This cellular machine is responsible for selectively degradation of intracellular proteins in order to allow proteome renewal, elimination of defective proteins and control of many biological functions. The objective of this thesis was to reveal the mechanisms by which the AAA-ATPase complexes selectively unfold substrate proteins and translocate them into the 20S particle, where they are destroyed. To this end, an innovative approach was used by combining time-resolved small-angle neutron scattering (TR-SANS) combined with fluorescence spectroscopy to monitor biochemical activity. The proteasome of the hyperthermophilic archaea Methanocaldococcus jannaschii was used as a model system. It is composed of the 20S protease of the regulatory particle AAA-ATPase PAN. A variant of the fluorescent protein GFP was used as a substrate protein.The data obtained show that PAN unfolding activity generates denatured species of GFP forming aggregates. The association with the 20S particle prevents the formation of these species and indicates that once the unfolding of a substrate by PAN is engaged, translocation into the 20S complex and degradation processes are closely coupled. Analysis of the neutron scattering spectra of the GFP substrate reveal that the native GFP population is rapidly disappearing in favor of peptides generated by the 20S protease, as confirmed by mass spectrometric analysis. This demonstrates the highly processive nature of the proteasome. Finally, two modes of action of PAN have been identified depending on the amount of proteins to be degraded compared to the PAN-20S proteasome. This work allows to experimentally validate one of the proteasome function models previously proposed and emphases the importance of controlling the association of proteasomes in vivo. This study also highlights the interest of TR-SANS technique to study the functional dynamics of large cellular machines.
Les protéasomes sont de grands assemblages macromoléculaires ubiquitaires composés d’un complexe catalytique 20S et d’une particule régulatrice comprenant un module AAA-ATPase. Cette machine cellulaire est chargée de dégrader sélectivement les protéines intracellulaires pour permettre le renouvellement du protéome, éliminer les protéines défectueuses et contrôler de nombreuses fonctions biologiques. Le travail de cette thèse avait pour objectif de mettre à jour les mécanismes qui permettent aux complexes AAA-ATPase de déplier sélectivement les protéines substrat et de les transférer à la particule 20S, dans laquelle elles sont détruites. Pour cela, une approche novatrice a été utilisée en combinant la diffusion de neutrons aux petits angles résolue en temps (TR-SANS) avec la spectroscopie de fluorescence permettant de suivre l’activité biochimique. Le protéasome de l’archée hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii, a été utilisé comme système modèle. Il est composé de la protéase 20S et de la particule régulatrice AAA-ATPase PAN. Un variant de la protéine fluorescente GFP a été utilisé comme protéine substrat.Les données obtenues montrent que l’activité de dépliement de PAN génère des formes de GFP dénaturée formant des agrégats. En revanche, l’association avec la particule 20S prévient la formation de ces espèces et indique qu’une fois le dépliement d’une protéine par PAN engagé, les processus de transfert dans le complexe 20S et de dégradation sont étroitement couplés. L’analyse des spectres de diffusion neutronique du substrat GFP montrent que la population de GFP native disparait rapidement au profit des peptides générés par la protéase 20S, comme confirmé par une analyse en spectrométrie de masse. Cela démontre le caractère hautement processif du protéasome. Enfin, deux modes d'action de PAN ont été mis en évidence selon la quantité de protéines à dégrader par rapport au protéasome PAN-20S. Ces travaux permettent de valider expérimentalement un des modèles de fonctionnement du protéasome préalablement proposés et soulignent l’importance d’un contrôle de l’association des protéasomes in vivo. Cette étude met également en valeur l’intérêt de la technique TR-SANS pour étudier la dynamique fonctionnelle de grandes machines cellulaires.
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  • HAL Id : tel-02930469 , version 1

Citer

Emilie Mahieu. Étude du mécanisme d’action du protéasome PAN-20S par diffusion de neutrons aux petits angles résolue en temps. Biophysique. Université Grenoble Alpes, 2019. Français. ⟨NNT : 2019GREAY073⟩. ⟨tel-02930469⟩
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