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Thèse Année : 2020

TDP1 deficiency and genomic instability in non-replicating cells

Déficience en TDP1 et instabilité génomique dans les cellules non-réplicatives

Résumé

Spinocerebellar ataxia with axonal neuropathy (SCAN1) is a rare recessive neurodegenerative syndrome associated with cerebellar atrophy and peripheral neuropathy. It is caused by a homozygous missense mutation in the tyrosyl-DNA phosphodiesterase-1 (TDP1) gene (A1478G). This results in a substitution of histidine for arginine-493 (H493R) in the TDP1 catalytic site, leading to a reduced TDP1 activity. TDP1 hydrolyses the bond between a DNA 3’-end and a tyrosyl moiety within a trapped topoisomerase I cleavage complex (TOP1cc). TDP1 not only excises trapped TOP1ccs but also processes other 3’-end-blocking lesions, including 3’-phosphoglycolates that result from oxidation. Even so, how TDP1 H493R mutation promotes the SCAN1 phenotype, which is associated with the death of post-mitotic neurons, is unclear. DNA double-strand breaks (DSBs) are infrequent but among the most harmful genomic lesions. Their defective repair can induce cell death, and they have been implicated in the pathogenesis of several human diseases, including neurodegenerative syndromes. Hence, my Ph.D. objective was to investigate whether the SCAN1 phenotype could be related to an accumulation of DSBs in non-replicating cells harboring the H493R mutation of TDP1. The only available models to study the impact of TDP1 H493R mutation were lymphoblastoid cell lines derived from SCAN1 patients compared to those of healthy individuals. Hence, we have generated models of osteosarcoma U2OS cells homozygous for TDP1 H493R or TDP1 KO employing the CRISPR-Cas9 technique. We have also generated primary lung WI38 hTERT fibroblasts TDP1 KO. We found that both TDP1 H493R and TDP1 KO cells accumulate endogenous DSBs, primarily in the G1 phase of the cell cycle compared to S phase. A similar increase of DSBs was observed in quiescent WI38 hTERT cells following depletion of TDP1 with siRNA, suggesting the replication-independent nature of DSBs. Treatment of TDP1 H493R and TDP1 KO cells with camptothecin to induced trapped TOP1ccs, further suggests that accumulation of DSBs could be related to the defective removal of TOP1ccs. Next, we asked whether DSB accumulation in those cells could be related to an increase in DSB production and/or a defect in their repair. Notably, R-loop structures that form co-transcriptionally can induce DSBs in non-replicating cells. We found that TDP1 deficiency modulated R-loop levels at some gene loci, raising the possibility of their implication in DSB formation. Analysis of DSB repair following camptothecin treatment revealed that both TDP1 H493R and TDP1 KO cells were defective in the repair of DSBs in G1 but not in S, with TDP1 H493R having the most pronounced effect. These results suggest that DSBs would accumulate specifically in TDP1-deficient cells that do not undergo replication, due to a defective repair of those breaks. Together, our results provide insights on the etiology of the SCAN1 neurodegenerative syndrome. This work was supported by a PhD fellowship under the French-Italian University VINCI Program 2016.
L'ataxie spinocérébelleuse avec neuropathie axonale (SCAN1) est un rare syndrome neurodégénératif récessif associé à une atrophie cérébelleuse et à une neuropathie périphérique. Il est causé par une mutation homozygote dans le gène tyrosyl-ADN phosphodiestérase-1 (TDP1) (A1478G). Cette mutation entraîne une substitution de l'histidine 493 par une arginine (H493R) dans le site catalytique de TDP1, ce qui conduit à une diminution de l’activité de TDP1. TDP1 hydrolyse la liaison entre une extrémité 3' de l'ADN et une tyrosine au sein d'un complexe de clivage de la topoisomérase I (TOP1cc) piégé sur la chromatine. TDP1 n'excise pas seulement les TOP1cc piégés, mais répare également d'autres lésions bloquant l'extrémité 3', notamment les 3'-phosphoglycolates qui résultent d’une oxydation. Toutefois, le mécanisme par lequel la mutation TDP1 H493R entraine le phénotype SCAN1, qui est associé avec la mort des neurones post-mitotiques, est peu connu. Les cassures double-brin (DSBs) de l'ADN sont peu fréquentes mais parmi les lésions génomiques les plus sévères. Un défaut de réparation peut induire la mort cellulaire, et elles ont été impliquées dans la pathogénèse de nombreuses maladies humaines, incluant des syndromes neurodégénératifs. Mon objectif de doctorat a été de déterminer si le phénotype SCAN1 pouvait être lié à une accumulation de DSBs dans des cellules non réplicatives portant la mutation TDP1 H493R. Les seuls modèles disponibles pour étudier l'impact de cette mutation étaient des lignées de cellules lymphoblastoïdes provenant de patients SCAN1 comparées à celles d'individus sains. Nous avons donc généré des modèles de cellules d'ostéosarcome U2OS homozygotes pour TDP1 H493R ou TDP1 KO en utilisant la technique CRISPR-Cas9. Nous avons également généré des cellules primaires de poumon WI38 hTERT TDP1 KO. Nous avons observé que les cellules TDP1 H493R et TDP1 KO accumulent des DSBs endogènes, principalement dans la phase G1 du cycle cellulaire par rapport à la phase S. Une augmentation de DSBs a également été observée après déplétion de TDP1 par siRNA dans les cellules WI38 hTERT quiescentes, suggérant la nature réplication-indépendante de ces DSBs. Le traitement des cellules TDP1 H493R et TDP1 KO par la camptothécine, qui induit spécifiquement des TOP1ccs, suggère en outre que l'accumulation de DSBs pourrait être liée au défaut d'élimination des TOP1ccs. Ensuite, nous nous sommes demandé si l'accumulation de DSBs dans ces cellules pouvait être liée à une augmentation de la production de ces DSBs et/ou à un défaut dans leur réparation. Notamment, les structures R-loops qui se forment lors de la transcription peuvent induire des DSBs dans les cellules non réplicatives. Nous avons montré que la déficience en TDP1 modulait les R-loops sur certains gènes, ce qui soulève la possibilité de leur implication dans la formation de DSBs. L'analyse de la réparation des DSBs après traitement par la camptothécine a révélé que les cellules TDP1 H493R et TDP1 KO étaient toutes deux défectueuses dans la réparation des DSBs en G1 mais pas en S, la mutation TDP1 H493R ayant l'effet le plus prononcé. Ces résultats suggèrent que les DSBs pourraient s'accumuler spécifiquement dans les cellules déficientes en TDP1 qui ne répliquent pas en raison d'une réparation défectueuse de ces cassures. L’ensemble des notre résultats apporte de nouvelles informations sur l'étiologie du syndrome neurodégénératif SCAN1. Ce travail a été soutenu par une bourse de doctorat dans le cadre du programme universitaire franco-italien VINCI 2016.

Domaines

Cancer
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03336542 , version 1 (07-09-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03336542 , version 1

Citer

Simona Salimbeni. TDP1 deficiency and genomic instability in non-replicating cells. Cancer. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2020. English. ⟨NNT : 2020TOU30065⟩. ⟨tel-03336542⟩
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