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Theses Year : 2020

Hereditary Peripheral Neuropathies : from Molecular Genetics to a cellular model of hiPSC-derived motor neurons

Neuropathies Périphériques Héréditaires : de la Génétique Moléculaire au modèle cellulaire de motoneurones dérivé d'hiPSC

Abstract

Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease is the most common hereditary peripheral neuropathy. To date, more than 80 genes have been identified to be involved in CMT, but genetic diagnosis is achieved only in 30-40% of cases. This study presented two main objectives: first, we focused on CMT and associated peripheral neuropathies using molecular and bioinformatic approaches to optimize their genetic characterization ; secondly, we investigated impaired mechanisms in an axonal CMT form, by creating a human cellular model of human induced pluripotency stem cells (hiPSC) and their differentiation into motor neurons (MN).In the first part of the project, we developed a new bioinformatic tool, CovCopCan, to detect Copy Number Variations (CNV), starting from NGS data. Thanks to CovCopCan, two new CNV have been identified and we discuss their involvement in two complex cases of peripheral neuropathy. We also identified three genetic variations in a CMT patient highlighting that CMT can be a multilocus genetic pathology. In the second part of the project, we successfully generated a cellular model of MN for the study of GDAP1 gene and its associated CMT2H form. We reprogrammed dermal fibroblasts of five control subjects and two CMT patients, carrying two different homozygous codon-stop mutations in GDAP1, into human inducedpluripotent stem cells (hiPSC). Then, we established a differentiation protocol to generate MN from hiPSC.MN with the GDAP1 p.Ser194* mutation were analyzed by expression, morphological, and functional tests. We confirmed the neural expression of GDAP1, and we suggested that oxidative stress and mitochondrial impairment could be responsible for the pathological condition in CMT2H MN. Taken together, our results highlighted that both genetic and functional analyses are essential in the complete characterization of CMT disease.
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente. Actuellement plus de 80 gènes ont été identifiées comme étant à l’origine des CMT, mais le diagnostic génétique est posé seulement dans 30 à 40% des cas. Cette étude avait deux objectifs principaux : dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux CMT et neuropathies périphériques associées via une approche moléculaire et bioinformatique, pour optimiser leur caractérisation génétique ; dans un second temps, nous avons étudié les mécanismes altérés dans une forme axonale de CMT, par la création d’un modèle cellulaire humain de cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSc) et leur différenciation en motoneurones (MN). Dans la première partie du projet, nous présentons un nouvel outil bioinformatique, CovCopCan, développé au sein de l’équipe pour détecter les Variations du Nombre de Copies (CNV), à partir des données de NGS. Grâce à CovCopCan, deux nouveaux CNV ont été identifiés et nous discutons leur implication dans deux cas complexes de neuropathie périphérique. Nos travaux ont également permis de mettre en évidence trois variations génétiques chez un patient CMT, soulignant que la CMT peut être une pathologie génétique multilocus. Dans la deuxième partie de ce travail, un modèle cellulaire de MN a été créé pour étudier le gène GDAP1 et son implication dans le CMT2H. Nous avons reprogrammé des fibroblastes dermiques de cinq sujets contrôles et de deux patients CMT, portant deux mutations codon-stop homozygotes sur le gène GDAP1, en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous avons ensuite mis au point un protocole de différenciation pour générer des MN à partir d’hiPSC. Les MN avec la mutation p.Ser194* sur GDAP1 ont été analysés par des tests fonctionnels, morphologiques et d’expression. Nous avons confirmé l’expression neuronale de GDAP1, et nous avons mis en évidence que le stress oxydant et la dysfonction mitochondriale étaient à l’origine de la pathologie dans les MN CMT2H. Nos résultats ont montré que les analyses génétique et fonctionnelle sont essentielles pour la caractérisation complète de la maladie de CMT.
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  • HAL Id : tel-03476074 , version 1

Cite

Federica Miressi. Hereditary Peripheral Neuropathies : from Molecular Genetics to a cellular model of hiPSC-derived motor neurons. Human health and pathology. Université de Limoges, 2020. English. ⟨NNT : 2020LIMO0053⟩. ⟨tel-03476074⟩
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