L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus.