La microscopie à localisation de molécules uniques est une méthode puissante pour étudier les processus biologiques à une résolution nanométrique. Cependant, dans cette technique, les échantillons biologiques sont généralement fixés chimiquement pour éviter les mouvements. Comme la fixation chimique peut produire des artefacts à ces hautes résolutions, il est nécessaire de développer des stratégies de fixation alternatives. Une solution consiste à congeler les échantillons à une température cryogénique, ce qui présente également d'autres avantages, comme par exemple la possibilité de réaliser des études cryocorrélatives avec la cryo-EM. Un défi important est cependant le manque de marqueurs fluorescents capables de photocommuter efficacement à température cryogénique. Les fluorophores organiques qui sont généralement utilisés en microscopie ne peuvent pas être utilisés, car leur commutation est basée sur la diffusion des molécules du tampon STORM, qui est entravée en dessous de la température de transition vitreuse. En outre, peu de fluorophores organiques peuvent traverser la membrane des cellules vivantes, et une fixation chimique reste donc souvent nécessaire. A l’inverse, les protéines fluorescentes sont codées génétiquement et peuvent être exprimées directement avec la protéine d'intérêt et aucune fixation n'est donc nécessaire. Elles sont donc les meilleurs candidats pour être utilisées comme marqueurs fluorescents pour la microscopie de localisation de molécules uniques à température cryogénique, mais des stratégies pour les photocommuter plus efficacement sont nécessaires, car leur flexibilité conformationnelle est réduite à cette température.Nous avons réalisé des études spectroscopiques et structurales sur la protéine fluorescente rsEGFP2 et nous avons également étudié d'autres protéines (rsEGFP2-V151A, rsEGFP2-V151L, mEmerald et EGFP) à température ambiante et à température cryogénique afin de comprendre leurs mécanismes de photocommutation Nous avons développé une stratégie d'illumination pour améliorer leur retour de l'état non-fluorescent à l'état fluorescent à température cryogénique. Nous avons observé que pour rsEGFP2, le mécanisme de photocommutation cryogénique est structuralement et spectroscopiquement différent du mécanisme à température ambiante. Contrairement à une isomérisation cis-trans à température ambiante, aucun changement structural majeur entre l'état fluorescent et l'état non-fluorescent n'a été observé par cristallographie aux rayons X à température cryogénique. Les études de microspectrophotométrie d'absorbance et de fluorescence ont mis en évidence deux états non-fluorescents différents qui se produisent lors de la photocommutation cryogénique, tous deux décalés vers le bleu par rapport à l'état non-fluorescent observé après la commutation à température ambiante. Avec le laser 405 nm généralement utilisé, seul l'un des états non-fluorescents peut être ramené à l'état fluorescent. Nous avons observé qu'avec un laser 355 nm, les deux états non-fluorescents sont récupérables, ce qui permet d'améliorer significativement le retour de l'état fluorescent. Il est intéressant de noter que la photocommutation de mEmerald et d'EGFP aux températures ambiantes et cryogéniques semble très similaire à la commutation de rsEGFP2 à température cryogénique, ce qui indique que ce nouveau mécanisme de commutation pourrait être général aux protéines de la famille GFP. L'utilisation d'un laser de 355 nm pour activer des protéines fluorescentes comme rsEGFP2, mEmerald et EGFP à cryo-température pourrait permettre d'obtenir un marquage effectif plus efficace dans les applications de microscopie de localisation de molécules uniques à cryo-température.