Self-interference 3D localization microscopy in the near-infrared for deep tissue single-particle tracking
Microscopie de localisation 3D par auto-interférence dans le proche infrarouge pour le suivi de particules uniques dans les tissus profonds
Résumé
Fluorescence microscopy has achieved over the last decade super-resolution localization of single emitters with numerous applications in biological imaging. However, dynamic 3D localization of single emitters at depth in living biological tissues remains a challenge. A few years ago, our team developed the SELFI method (self-interference 3D super-resolution microscopy), allowing the 3D localization of single molecules in specimens and multicellular tissues in the visible wavelength range. In this thesis, we extend the applicability of SELFI in the near-infrared (NIR) region for dynamic studies, where the fluorescence of single-walled carbon nanotubes (SWCNT) is intense. SWCNTs are indeed now used as fluorescent probes for dynamic studies in deep biological tissue, as they allow excellent tissue penetration, low light scattering and reduced tissue absorption. The objective of this work is thus to develop NIR SELFI for single particle tracking applications using SWCNTs in living brain tissue. SELFI uses a diffraction grating placed in the optical path of the sample image, generating an interference pattern without significant spreading of the intensity distribution generated by the image of a point emitter. A single image obtained with NIR SELFI then contains two independent pieces of information: the intensity distribution to extract the lateral super-localization of the emitter and the curvature of the wavefront (provided by the interfringes) to obtain the axial super-localization of the emitter. To adapt SELFI to the super-localization of single SWCNTs, we designed and implemented an optical system adapted to near-infrared emission. The experiments performed allowed to obtain 3D resolutions of about 50 nm considering emitters at 985 nm. We then performed the 3D tracking of individual SWCNTs at video rate in complex environments, including agarose gels, before applying the method in organotypic rat brain slices.
La microscopie de fluorescence a réussi à atteindre au cours de la dernière décennie la localisation super-résolutive d'émetteurs uniques avec de nombreuses applications en imagerie biologique. La localisation dynamique en 3D d’émetteurs et en profondeur dans des tissus biologiques vivants reste cependant un défi. Il y a quelques années, notre équipe a développé la méthode SELFI (self-interference 3D super-resolution microscopy), permettant la localisation 3D de molécules uniques dans des spécimens et des tissus multicellulaires dans le domaine de longueurs d’onde visibles. Dans cette thèse, nous étendons les capacités de SELFI dans la région du proche infrarouge (NIR) pour des études dynamiques, où la fluorescence des nanotubes de carbone monoparois (SWCNT) est intense. Les SWCNT sont en effet désormais utilisés comme sondes fluorescentes de mobilité des tissus biologiques en profondeur, car ils permettent une excellente pénétration des tissus, une faible diffusion de la lumière et une absorption réduite par les tissus. L'objectif de ce travail est ainsi de développer le SELFI NIR pour des applications de suivi de particules uniques utilisant les SWCNTs dans des tissus cérébraux vivants. SELFI utilise un réseau de diffraction placé sur le chemin optique de l'image de l'échantillon, générant un motif d'interférence sans étalement significatif de la distribution d’intensité de l’image d’émetteurs ponctuels. Une seule image obtenue avec SELFI NIR contient alors deux informations indépendantes : la distribution d'intensité pour extraire la super-localisation latérale de l’émetteur et la courbure du front d'onde (fournie par les interfranges) permettant d’obtenir la super-localisation axiale de l’émetteur. Pour adapter SELFI à la super-localisation de SWCNT uniques, nous avons conçu et mis en œuvre un système optique adapté à une émission dans le proche infrarouge. Les expériences réalisées montrent que la résolution 3D obtenue avec le SELFI NIR est d'environ 50 nm pour une émission autour de 985 nm. Nous avons ensuite effectué le suivi 3D de SWCNTs individuels à une fréquence vidéo dans des environnements complexes, dont des gels d'agarose, avant d’appliquer la méthode dans des tranches de cerveau organotypiques de rat.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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