Etude in vitro et in silico de l'extraction, modification chimique et assemblage de phospholipides pour la construction de nouvelles vésicules végétales : exemple de la caméline - TEL - Thèses en ligne
Thèse Année : 2019

In vitro and in silico study of the extraction, chemical modification and assembly of phospholipids for the elaboration of new vegetable vesicles : example of camelina

Etude in vitro et in silico de l'extraction, modification chimique et assemblage de phospholipides pour la construction de nouvelles vésicules végétales : exemple de la caméline

Jean-François Fabre

Résumé

Within the framework of several research projects involving academic and industrial partners as local and national technical centers (CLE Region n°1405050981 : SMON-FERT, Carnot network 3BCAR : CAMELINOIL, ITE PIVERT n° 2015-GENESYS-WP3P18-063 PROBIORAF, FEDER Convention N°16004168 : CHIA-EASYNOV), generic studies of integrated schemes have been designed to valorise mucilage and phospholipids from mucilaginous oilseeds, taking here the example of camelina. As the outermost surface layer of the seeds, mucilage can be effectively extracted by using an ultrasonic reactor with adequate shear conditions. Its composition and derived properties (as the viscoelastic behaviour) strongly depend on the parameters of its extraction, in particular the processing time, as revealed by the continuous monitoring of several responses (motor torque, pH, conductivity, refractive index). The omega-3 rich oil is then easily extracted from whole or demucilaginated seeds by single screw pressing for food and oleochemical needs in these different programs. According to chromatographic analyses and a specifically developed colorimetric method, it appears that if the oil extraction yield depends on the moisture content of the seeds, the phospholipid extraction yield remains low, these polar compounds being mainly found in the meal. Phospholipids can be recovered from the extracted oil by ultrasound-assisted precipitation with the presence of a small amount of water. Concerning the meal, as it is mucilage-free, it can be easily treated with water. However, the activation of enzymes in this solvent encourages the use of organic ones. A couple of solvents such as ethanol and ethyl acetate is used to replace the traditional methanol/chloroform mixture, giving similar yields with a supposedly much lower impact on health and environment, as well as on the potential further use of the meal. The composition of phospholipids largely determines the properties of the vesicles they can form in an aqueous medium. To extend these properties, particularly in the field of encapsulation of nutrients or elicitors for plants in the SMON-FERT program, a chemical modification of phospholipids has been undertaken. The use of low concentrations (<0.1 mM) of methylene blue, in the presence of air and under illumination (for the generation of singlet oxygen), allows the production of hydroperoxides from model phospholipids (soy lecithin) dissolved in ethanol. Using two variables (photosensitizer concentration and air volume) response surface methodology allows the oxidation to be modulated to produce vesicles of different sizes, charges and ionic permeability. If excessive oxidizing conditions result in the loss of encapsulation properties, moderate conditions allow the production of smaller vesicles with increased water and KCl permeability compared to unoxidized vesicles. Molecular dynamics study in "all atom" and "coarse grain" modes makes it possible to link this increased permeability to a decrease in membrane thickness, an increase in the area per lipid and a greater heterogeneity of the vesicles formed. The combination of in vitro and in silico tools can thus provide a way to adapt the chemical modification of phospholipids to the desired functional properties.
Dans le cadre de plusieurs projets de recherche impliquant des partenaires académiques, industriels, et centres techniques locaux et nationaux (CLE Région n°14050981 : SMON-FERT, Réseau Carnot 3BCAR : CAMELINOIL, ITE PIVERT n° 2015-GENESYS-WP3P18-063 PROBIORAF, FEDER Convention N°16004168 : CHIA-EASYNOV), des approches d’études génériques de schémas intégrés ont été conçues pour valoriser le mucilage et les phospholipides de graines oléoprotéagineuses à mucilage, prenant ici l’exemple de la caméline. Présent à la surface des graines, le mucilage peut être efficacement extrait par l'utilisation d’une colonne à ultrasons alliée à des conditions de cisaillement adéquates. Sa composition et les propriétés qui peuvent en découler (comportement viscoélastique notamment) dépendent fortement des conditions de son extraction, en particulier du temps de traitement, comme le révèle le suivi continu de plusieurs paramètres (couple moteur, pH, conductivité, indice de réfraction). Riche en omega-3, l’huile est ensuite extraite des graines entières ou démucilaginées par pressage monovis pour les besoins alimentaires et de l’oléochimie dans ces différents programmes. Les phospholipides peuvent ensuite être récupérés par un traitement ultrasonore de l’huile en présence d’une faible quantité d’eau. Selon une méthode colorimétrique mise au point et des analyses chromatographiques, il apparait que si le rendement d’extraction d’huile dépend du taux d’humidité des graines, l’huile extraite contient peu de phospholipides, ceux-ci se retrouvant principalement dans le tourteau. Etant démucilaginé, ce dernier peut se prêter plus facilement à un traitement aqueux. Cependant, l’activation d’enzymes dans ce milieu impose le recours à des solvants organiques. Un couple de solvants comme l’éthanol et l’acétate d’éthyle est utilisé en remplacement du couple traditionnel méthanol/chloroforme, donnant des rendements similaires avec un impact supposé bien moindre sur la santé, l’environnement, de même que sur les possibilités de valorisation du tourteau. La composition des phospholipides détermine en grande partie les propriétés des vésicules qu’ils peuvent former en milieu aqueux. Pour élargir ces propriétés, notamment dans le domaine de l’encapsulation d’éléments nutritifs ou éliciteurs pour les plantes dans le programme SMON-FERT, une modification chimique des phospholipides a été entreprise. L’utilisation de faibles concentrations (<0,1 mM) de bleu de méthylène, en présence d’air et sous illumination (pour la génération de l’oxygène singulet), permet l’obtention d’hydropéroxydes à partir de phospholipides modèles (lécithine de soja) dissous dans l’éthanol. La variation de la concentration en photosensibilisateur et du volume d’air disponible permet de moduler le rendement d’oxydation des phospholipides pour aboutir à des vésicules de différentes tailles, charges et perméabilités ioniques. Si des conditions oxydantes trop poussées aboutissent à la perte des propriétés d’encapsulation, des conditions modérées permettent l’obtention de vésicules plus petites avec une perméabilité accrue de l’eau et de KCl. La dynamique moléculaire en mode « tout atome » et « gros grains » permet de relier cette perméabilité accrue à une diminution de l’épaisseur de la membrane, une augmentation de l’aire occupée par phospholipide et une plus grande hétérogénéité des vésicules formées. La combinaison d’outils in vitro et in silico peut ainsi permettre de comprendre comment adapter la modification chimique des phospholipides aux propriétés fonctionnelles voulues.
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Citer

Jean-François Fabre. Etude in vitro et in silico de l'extraction, modification chimique et assemblage de phospholipides pour la construction de nouvelles vésicules végétales : exemple de la caméline. Sciences agricoles. Institut National Polytechnique de Toulouse - INPT, 2019. Français. ⟨NNT : 2019INPT0066⟩. ⟨tel-04167838⟩
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