Impact of mechanical stress on nucleus morphology and transcription on skeletal muscle
Impact du stress mécanique sur la forme du noyau et la transcription dans le muscle squelettique
Résumé
The lamina, and specifically A-type lamins, are major contributors to nuclear stiffness and deformations. However, chromatin and its histone modification states also contribute to nuclear mechanics independently of A-type lamins. How A-type lamins and chromatin-mediated mechanoresponse contribute to mechanical load-mediated adaptation in normal and pathological skeletal muscle remains unknown. We sought to determine how muscle differentiation impacts nuclear characteristics in muscle cell precursors (MuSCs) and myotubes. Then, we investigated the respective roles of nuclear envelope proteins (lamin A/C, SUN1 and SUN2) and drug-modulated chromatin compaction on the mechanical load-mediated nuclear response in myonuclei. We used immortalized MuSCs obtained from healthy patients and analyzed nuclear shape and chromatin characteristics in MuSCs and myotubes obtained after 72h of differentiation. Histone modifications were analyzed: a) histone H3 lysine4 tri-methylation (H3K4me3) and H3K4 acetylation (H3K4ac), associated with transcriptionally active genes, b) H3K27 tri-methylation (H3K27me3), a chromatin repression marker, associated with facultative heterochromatin and c) H3K9 tri-methylation (H3K9me3), a chromatin repression marker associated with constitutive heterochromatin and mainly located at the nuclear periphery. Myotube differentiation was associated with nuclear elongation and significant reduction in nuclear volume. In addition, the relative intensity of nuclear H3K27me3 (chromatin repression marker) labelling was significantly lower in myotubes compared to MuSCs, whereas nuclear H3K9me3 and H3K4me3 (chromatin active marker) intensities were higher in myotubes compared to MuSCs, thereby showing that myogenic differentiation is modulating the accessibility of the transcriptional machinery. Myotubes were silenced for LMNA expression with silencing mRNA strategies and submitted to a cyclic stretch (10%,4hours) to investigate A-type lamin’ roles in nuclear shape and chromatin organization during mechanical stress. A-type lamin deficient myotubes had abnormal nuclear shape in static conditions and nuclear deformations further increased after cyclic stretch. Cyclic stretch was associated with a significant increase in nuclear volume in control myotubes that was abolished in A-type lamin deficient myotubes. In addition, stretching increased the intensity of the H3K27me3 and reduced H3K4me3 and H3K4ac intensities of labelling in nuclei from control myotubes. Importantly, A-type lamin deficiency was associated with higher intensity in chromatin active markers at baseline and a paradoxical increased in H3K4me3 after stretch. Consistent modifications in histone modifications were obtained by western-blots in control and A-type deficient myotubes. Interesting, stretch reduced H3K4me3 intensity both in SUN2 or SUN1-deficient myotubes while the increase in the nuclear intensity of the H3K27me3 was abolished in stretched SUN2-deficient myotubes. Transcriptomic changes associated with A-type lamin deficiency support these results. Trichostatin A (TSA) is a powerful and specific Class I and II histone deacetylase inhibitor (HDACi), widely used to increase the expression of genes silenced by chromatin condensation, thereby favoring chromatin decompaction. TSA increased nuclear volume without affecting nuclear shape both in static and stretched conditions. In addition, TSA decreased H3K27me3 and H3K9me3 intensities in static myotubes but did not prevent the stretch-induced increase in H3K27me3 intensity. Overall, our study highlights crucial changes of histone post-translational markers during muscle differentiation and upon mechanical challenge. A-type lamins appear crucial to prevent abnormal activation of chromatin active markers in mechanically challenged myotubes. Moreover, our results suggest that the nuclear mechano-response is tightly regulated by nuclear envelope proteins in skeletal muscle.
La réponse du noyau aux contraintes mécaniques impliquent les lamines de type A mais aussi la chromatine et les modifications post-traductionnelles des histones. Cette réponse est essentielle à l’adaptation des cellules aux contraintes mécaniques, notamment dans les tissus soumis à des contraintes mécaniques importantes comme le muscle squelettique. Cependant les mécanismes impliqués restent mal connus. Le premier objectif de ma thèse était de déterminer l'impact de la différenciation musculaire sur les caractéristiques nucléaires de cellules musculaires. Les objectifs suivants étaient d’analyser l’effet de l’expression des protéines de l'enveloppe nucléaire (lamines A/C, SUN1 et SUN2) et de la compaction de la chromatine sur la réponse nucléaire aux contraintes mécaniques. J’ai caractérisé la forme nucléaire et des marqueurs d’histone dans des cellules précurseurs musculaires (MuSC) immortalisées obtenus chez des patients sains et dans des myotubes (72h de différenciation). Les marqueurs d’histones suivants ont été analysés : 1-La tri-méthylation de la lysine4 de l'histone H3 (H3K4me3) et l'acétylation de H3K4 (H3K4ac), associés aux gènes activement transcrits 2- H3K27me3, un marqueur de l'hétérochromatine facultative, régulé par le développement 3- et H3K9me3, un marqueur de l'hétérochromatine constitutive. La différenciation en myotubes est associée à une élongation et à une réduction significative du volume nucléaire. De plus, l'intensité du marquage nucléaire H3K27me3 est significativement plus faible dans les myotubes par rapport aux MuSC alors que les intensités nucléaires H3K9me3 et H3K4me3 sont plus élevées. Ces résultats sont compatibles avec les modifications attendues de l'accessibilité de la machinerie transcriptionnelle avec la différenciation myogénique. Dans les myotubes, la déficience en lamines A/C entraîne une déformation nucléaire qui est majorée par le stretch mécanique (étirement cyclique de 10%, 4h) Le stretch est associé à une augmentation significative du volume nucléaire dans les myotubes témoins, qui est abolie dans les myotubes déficients en lamines A/C. Dans les myotubes témoins, le stretch augmente l'intensité du marquage H3K27me3 et réduit l'intensité du marquage H3K4me3 et H3K4ac. Dans les myotubes déficients en lamines A/C, l’intensité des marqueurs actifs de la chromatine est plus élevée en conditions statiques et stretch s’accompagne d’une augmentation paradoxale de H3K4me3 après. L’inhibition spécifique des histones désacétylases de classe I et II par la trichostatine A induit également une augmentation de H3K4ac en conditions statique et après stretch par rapport au myotubes témoins. A l’inverse, dans les myotubes déficients en SUN2 ou SUN1, l'étirement réduit l'intensité de H3K4me3, alors que l'augmentation de l'intensité nucléaire de H3K27me3 est abolie dans les myotubes déficients en SUN2 étirés. Par ailleurs, la déficience en lamines A/C s’accompagne d’une dérégulation majeure des gènes régulant les marqueurs d’histone. Dans l'ensemble, notre étude met en évidence des modifications importantes des marqueurs post-traductionnels des histones au cours de la différenciation musculaire et lors d'un stress mécanique. Les lamines de type A semblent cruciales pour prévenir l'activation anormale des marqueurs actifs de la chromatine dans les myotubes soumis à un défi mécanique. Nos résultats suggèrent que la mécano-réponse chromatinienne est étroitement régulée par les protéines de l'enveloppe nucléaire dans le muscle squelettique.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
|---|