Réponse au mercure et production de méthylmercure par une bactérie sulfato réductrice : Identification de déterminismes génétiques. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Mercury response and methylmercury production by a sulfate-reducing bacterium : Identification of genetic determinisms

Réponse au mercure et production de méthylmercure par une bactérie sulfato réductrice : Identification de déterminismes génétiques.

Résumé

Mercury (Hg) is a persistent pollutant leading to environmental and health issues. The transformation of Hg(II) into the highly toxic methylmercury (MeHg) is carried out by some anaerobic microorganisms producing HgcA and HgcB proteins. The impact of environmental conditions on methylmercury production by methylating microorganisms has been described. However, genetic determinisms whose expression is induced for the microbial Hg response are almost unknown. This work aims to identify genetic determinisms involved in the Hg response and methylation in the model sulfate-reducing methylating bacterium Pseudodesulfovibrio hydrargyri strain BerOc1. For this purpose, gene-deleted mutant strains were generated. The targeted genes were selected from previous studies of genome organization analyses of Desulfovibrio and Pseudodesulfovibrio genus, and differential transcriptomics of P. hydrargyri BerOc1 growing with or without Hg(II). First, the required physiological characterization of the BerOc1 strain to set up a protocol in order to generate mutant strains was performed. In addition to the protocol set up, study on Hg(II) methylation showed the key role of sulfide concentration on MeHg production and export in P. hydrargyri BerOc1. However, Hg(II) methylation potentials measured under different Hg(II) and sulfide concentrations were not related to the hgcA gene expression induction. The second part of the work targeted P. hydrargyri BerOc1 ArsR protein, a putative transcriptional regulator encoded by an arsR gene found upstream hgcAhgcB genes, and was carried out using a strain deleted for arsR gene and overexpressing the hgcA gene. The higher methylation rates measured from 0.5 µM of Hg(II) in the mutant compared to the wild type strain strongly suggested that the methylation mechanism was limited by production of the HgcA protein. In contrast, (i) the increase of the demethylation rates regardless of the MeHg concentrations added, (ii) the lack of saturation of the demethylation rates and, (iii) the lack of sensitivity to MeHg (up to 4.7 µM) of the mutant strain suggested a role of the ArsR protein or the HgcA protein in MeHg demethylation reaction. These unexpected phenotypes inquire as to whether there is a link between methylation, demethylation and methylmercury resistance. This work also demonstrated for the first time, that the heterologous expression of solely arsRhgcAhgcB in the non methylating bacterium Desulfovibrio alaskensis G20 conferred the ability to methylate mercury. Furthermore, beyond the mechanisms of mercury transformation, this work underlined the role of the arsRhgcAhgcB gene cluster in cell physiology, particularly in cell motility. Finally, the last part of this work focused on the 470-467 gene cluster, mostly overexpressed in the presence of Hg(II). The mutant deleted of this gene cluster showed, from 0.5 µM of Hg(II), the inability to accumulate Hg(II) at the intracellular level. Moreover, (i) the sensitivity to Hg(II) was increased, (ii) the localization of Hg within the cell was largely diffuse and, (iii) the methylation rates saturated in the mutant compared to the wild type strain. The amino acid sequence homology of one of the deleted genes to a protein involved in periplasmic metal sequestration strongly suggests a relationship between Hg(II) sequestration and the capacity of methylating bacteria to resist Hg and reveals the first mechanism of resistance to Hg(II) in an anaerobic bacterium. These results established two genetic determinisms involved in the cellular response to Hg and its methylation and, that 0.5 µM Hg(II) is the threshold concentration driving the response of P. hydrargyri BerOc1 to cope with Hg. Overall, this work is a compilation of data dedicated to the progress of our understanding of Hg methylation mechanisms in Hg methylating microorganisms, crucial for risk assessments of mercury in the environment.
Le mercure (Hg) est un polluant persistant à l'origine de problèmes environnementaux et sanitaires. La transformation du Hg(II) en méthylmercure (MeHg), hautement toxique, est réalisée par certains microorganismes anaérobies capables de produire les protéines HgcA et HgcB. L'impact des conditions environnementales sur la production de MeHg par les microorganismes méthylants a été décrit. Cependant, les déterminismes génétiques dont l'expression est induite pour répondre au Hg restent peu connus. Ce travail vise ainsi à identifier des déterminismes génétiques impliqués dans la réponse au Hg et sa méthylation chez la bactérie sulfato réductrice méthylante modèle Pseudodesulfovibrio hydrargyri souche BerOc1. Pour cela, des souches mutantes de délétion ciblant certains gènes ont été générées. Les gènes ciblés ont été sélectionnés à partir de précédentes études sur l'organisation génomique des genres Desulfovibrio et Pseudodesulfovibrio et, de transcriptomique différentielle sur la souche BerOc1 menée avec ou sans Hg. Au préalable, une étude physiologique de la souche BerOc1 a été nécessaire pour optimiser un protocole de génération de souches mutantes. De plus, l'étude sur la méthylation du Hg(II) a permis de déterminer l'importance de la concentration en sulfures sur la production et l'export du MeHg chez la souche BerOc1. Néanmoins, les potentiels de méthylation mesurés sous différentes concentrations de Hg(II) et de sulfures n'ont pas été corrélés à l'induction de l'expression d'hgcA. La deuxième partie de ce travail s'est focalisée sur la protéine ArsR, un putatif régulateur transcriptionnel codé par le gène retrouvé en amont d'hgcAhgcB. Elle a été menée grâce à une souche délétée d'arsR surexprimant de plus hgcA. A partir de 0.5 µM de Hg(II), les taux de méthylation supérieurs mesurés chez cette souche comparée à la souche sauvage suggèrent que ce mécanisme est limité par la production d'HgcA. En revanche, (i) les taux de déméthylation mesurés supérieurs à ceux de la souche sauvage quelle que soit la concentration en MeHg ajoutée, (ii) l'absence de saturation des taux de déméthylation et, (iii) l'absence de sensibilité au MeHg chez la souche mutante suggèrent un rôle d'ArsR ou d'HgcA dans la déméthylation du MeHg. Il s'agit d'un phénotype inattendu soulevant des questions sur le lien entre la méthylation, la déméthylation et la résistance au MeHg. Cette étude a de plus démontré pour la première fois que l'expression du cluster arsRhgcAhgcB confère à lui seul la capacité à méthyler le Hg(II), lors de son expression hétérologue chez la bactérie non méthylante D. alaskensis G20 et, souligne qu'au-delà de la transformation du Hg, ce cluster joue un rôle dans la physiologie cellulaire, notamment sur la motilité. La dernière partie de ce travail a ciblé le cluster de gènes 470-467, dont la majorité est surexprimée en présence de Hg(II). Le mutant délété de ce cluster a montré à partir de 0.5 µM de Hg(II) un seuil d'accumulation du Hg(II) au niveau intracellulaire. Les résultats ont aussi révélé (i) une sensibilité au Hg(II) accrue, (ii) une localisation du Hg au sein de la cellule plus diffuse et, (iii) des taux de méthylation saturant chez la souche mutante comparée à la sauvage. L'homologie de la séquence protéique d'un des gènes délétés avec une protéine impliquée dans la séquestration périplasmique des métaux suggère un rôle de séquestration du Hg dans la capacité à résister au Hg(II) chez les bactéries méthylantes et révèle le premier mécanisme de résistance au Hg(II) chez une bactérie anaérobie. L'ensemble de ces travaux a ainsi identifié deux déterminismes génétiques impliqués dans la réponse au Hg et sa méthylation mais aussi, que 0.5 µM de Hg(II) est une concentration seuil conduisant à déclencher la réponse de la souche BerOc1 pour faire face au Hg. Globalement, ces travaux permettent de progresser dans la compréhension du mécanisme de méthylation du Hg, cruciale pour mesurer les risques liés au Hg dans l'environnement.
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Citer

Sophie Barrouilhet. Réponse au mercure et production de méthylmercure par une bactérie sulfato réductrice : Identification de déterminismes génétiques.. Biologie cellulaire. Université de Pau et des Pays de l'Adour, 2022. Français. ⟨NNT : 2022PAUU3025⟩. ⟨tel-04363225⟩
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