Surfaces polymères à Activité Enzymatique modulable - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Polymer surfaces with tunable enzymatic activity

Surfaces polymères à Activité Enzymatique modulable

Résumé

While the exploitation of plant biomass represents a great opportunity for the production of high value-added molecules or biofuels, it is very energy intensive and remains very limited in terms of yield and diversity of products extracted. One way to overcome these limitations is to look to nature for inspiration. Indeed, some microorganisms express complex cocktails within protein structures immobilized on the outer surface of their membranes in order to deconstruct and metabolize this biomass. The aim of this work is to provide an original approach to one of the questions raised by these processes of enzymatic deconstruction of a complex, insoluble substrate: how do these enzymes behave at the solid/liquid interface and how does their spatial proximity affect their action? To answer these questions, we have developed a unique approach to immobilize enzymes on an elastomer surface. By mechanically stretching the surface, we can vary the surface density of the enzymes and thus the distance between them.In the first part, we characterize all the elements used in this project. First, the four synthetic or commercial elastomer surfaces used for enzyme immobilisation are characterized both at the molecular level and in terms of their surface state. Then, the enzyme in question, a xylanase, is immobilized on the elastomers via a pair of Jo and In proteins, allowing oriented and covalent immobilisation. The aim is to ensure the activity of our immobilized enzymes.The second part of the thesis focuses on the functionalisation of the surfaces studied. First, the necessity of this functionalisation is highlighted, then the method used is described in detail. Finally, we describe the characterisation method developed to highlight the functionalisation of the different surfaces.The third part of the thesis characterises the grafting of proteins onto our elastomer surfaces. First, the protein Jo. Its grafting is achieved by a Michael thiol-maleimide reaction. This step required the implementation of a wide range of complementary approaches to finely characterize a complex process involving the immobilisation of a small amount of protein in a monolayer on a smooth surface. The xylanase, expressed in fusion with In, is then grafted onto the surface by covalent association of the Jo/In pair. This immobilisation step will again be characterized and the enzymes immobilized on the surface will be quantified using a method developed specifically for this project.The final part of the thesis investigates the effect of the distance between immobilized enzymes on their specific activity. The grafted surfaces, arranged on a stretching tool specifically developed during the course of this work, were stretched in increasing proportions, thereby increasing the distance between the enzymes. We show that a decrease of enzyme density on the surface, and therefore an increase in the distance between enzymes, leads to a proportional increase in their specific activity, approaching that of free enzymes in solution. We also highlight the technical limitations of our approach and propose some development solutions to exploit the full potential of our strategy.
L’exploitation de la biomasse végétale, bien que représentant une grande opportunité pour la production de molécules à haute valeur ajoutée ou de biocarburant, est très énergivore et reste très limitée en termes de rendement et de diversité des produits extraits. Pour contourner ces limites, une des possibilités est de s’inspirer de la nature. En effet, certains microorganismes expriment des cocktails complexes au sein de structure protéiques immobilisées à la surface externe de leur membrane, afin de déconstruire cette biomasse et de la métaboliser. Ce travail de thèse a pour objectif d’appréhender de manière originale une des questions soulevées lors de ces processus de déconstruction enzymatique d’un substrat complexe et insoluble : comment ces enzymes se comportent à l’interface solide/liquide et comment la proximité spatiale de ces enzymes impacte leur action ? Pour y répondre, nous avons développé une approche unique d’immobilisation d’enzymes sur une surface élastomère. Un étirement mécanique de cette surface permet alors de faire varier la densité surfacique en enzyme et donc la distance entre enzymes.Dans une première partie, nous caractérisons l’ensemble des éléments utilisés dans ce projet. Tout d’abord, les quatre surfaces élastomères, synthétiques ou commerciales, utilisées pour l’immobilisation d’enzyme sont caractérisées à la fois au niveau moléculaire mais aussi au niveau de leur état de surface. Ensuite l’enzyme en question, une xylanase, est immobilisée sur les élastomères via un couple de protéines Jo et In, autorisant une immobilisation orientée et covalente. Il s’agit alors de s’assurer de l’activité de nos enzymes immobiliséesUne seconde partie de la thèse se focalise sur la fonctionnalisation des surfaces étudiée. Il est dans un premier temps mis en évidence que cette fonctionnalisation est nécessaire, puis la méthode appliquée est détaillée. Dans un dernier temps, nous indiquons la méthode de caractérisation développée pour mettre en évidence la fonctionnalisation des différentes surfaces.La troisième partie de la thèse caractérise le greffage de protéine sur nos surfaces élastomères. Tout d’abord la protéine Jo. Son greffage est mis en place grâce à une réaction de Michael thiol-maléimide. Cette étape a nécessité la mise en œuvre d’un large éventail d’approches complémentaires afin de caractériser finement un processus complexe d’immobilisation d’une faible quantité de protéines en monocouche sur une surface lisse. Ensuite, la xylanase exprimée en fusion avec In, est greffée sur la surface par association covalente du couple Jo/In. Cette étape d’immobilisation est de nouveau caractérisée et une méthode de quantification développée spécifiquement dans ce projet permet alors de quantifier les enzymes immobilisées en surface.La dernière partie de la thèse permet d’étudier l’effet de la distance entre les enzymes immobilisées sur leur activité spécifique. Les surfaces greffée, disposées sur un outil d’étirement spécifiquement développé au cours de ces travaux, ont été étirées dans des proportions croissantes, augmentant de fait la distance entre les enzymes. Nous mettons en évidence qu’une diminution de la densité des enzymes en surface, et donc une augmentation de la distance entre enzyme entraine une augmentation proportionnée de leur activité spécifique, se rapprochant de celle des enzymes libres en solution. Nous pointons également les contraintes techniques de notre approche et proposons quelques solutions de développement afin d’exploiter au mieux le potentiel de notre stratégie.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04475549 , version 1 (23-02-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04475549 , version 1

Citer

Maxime Artico. Surfaces polymères à Activité Enzymatique modulable. Polymères. INSA de Toulouse, 2023. Français. ⟨NNT : 2023ISAT0040⟩. ⟨tel-04475549⟩
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