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Thèse Année : 2023

Towards the construction of an autotrophic Escherichia coli strain

Vers le développement d'une souche d'Escherichia coli autotrophe

Marion Schulz
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1365716
  • IdRef : 276535316

Résumé

Autotrophic microorganisms convert CO2 into biomass using energy from light or from the oxidation of inorganic molecules. When implementing biosynthetic pathways for the production of commodity chemicals or fuels, they offer the possibility to industrially valorize CO2. However, these organisms often lack genetic malleability and are limited in product range. Current knowledge of bacterial metabolism and various genome modification techniques make the implementation of an autotrophic metabolic regime in a heterotrophic background feasible. Escherichia coli, a facultative anaerobic heterotroph, is a versatile organism with a flexible metabolic network and proven qualities as a biotechnological platform organism, thus being a preferred target for such adaptation. The project is based on the usage of E. coli strains that rely on the supply of formate for the biosynthesis of essential metabolites for bringing to light the reductive activity of Formate dehydrogenases. NAD-dependent formate dehydrogenases (FDH) capable of the efficient conversion of CO2 to formate are structurally complex and operate with metal centers often entailing O2 toxicity. Recently, efficient in vitro reduction of CO2 to formate upon oxidation of NADH in the presence of O2 was reported for the Mo-dependent complex and soluble FDH from Cupriavidus necator (CnFDH). This research project had several objectives. First, it aimed to demonstrate the functionality of CnFDH in vivo within E. coli using various genetically engineered strains. Second, it explored alternative non-carbon energy sources, namely hydrogen and phosphite, to support E. coli growth. To achieve these goals, a combination of rational strain design and automated continuous culture in selective conditions (GM3 technology) was used to harness the potential of the enzymatic complexes tested. Additionally, the adaptation of an in vivo mutagenesis method for generating and selecting favorable mutants of NADH-regenerating enzymes was explored.
Les micro-organismes autotrophes convertissent le CO2 en biomasse en utilisant l'énergie lumineuse ou en oxydant des molécules inorganiques. En y exprimant des voies de biosynthèse pour la production de produits chimiques ou de carburants, elles offrent la possibilité de valoriser industriellement le CO2. Cependant, ces organismes manquent souvent de flexibilité génétique et sont limités en termes de gamme de produits. Les connaissances actuelles sur le métabolisme bactérien et les diverses techniques de modification du génome rendent la mise en place d'un régime métabolique autotrophe dans un contexte hétérotrophe réalisable. Escherichia coli, un hétérotrophe anaérobie facultatif, est un organisme polyvalent doté d'un réseau métabolique flexible et de qualités prouvées en tant que plateforme biotechnologique, en faisant ainsi une cible privilégiée pour ce type d'adaptation. Le projet s'appuie sur l'utilisation de souches d'E. coli qui dépendent de l'apport de formate pour la biosynthèse de métabolites essentiels, pour manifester l'activité réductrice de formate déshydrogénases. Les formate déshydrogénases (FDH) NAD-dépendantes capables de réduire efficacement le CO2 en formate ont une structure complexe et fonctionnent avec des centres métalliques, le plus souvent inactivés en présence d'O2. Récemment, la réduction significative du CO2 en formate lors de l'oxydation du NADH en présence d'O2 a été montrée in vitro pour la FDH soluble et Mo-dépendante de Cupriavidus necator (CnFDH). Ce projet de recherche avait plusieurs objectifs. Tout d'abord, il visait à démontrer la fonctionnalité de la CnFDH in vivo au sein d'E. coli en utilisant diverses souches génétiquement modifiées. Deuxièmement, il avait pour but d'explorer des sources d'énergie alternatives et non carbonées, l'hydrogène et le phosphite, pour soutenir la croissance d'E. coli. Pour atteindre ces objectifs, une combinaison de design rationnel des souches et de culture continue automatisée dans des conditions sélectives (technologie GM3) a été utilisée pour exploiter le potentiel des complexes enzymatiques testés. De plus, l'adaptation d'une méthode de mutagenèse in vivo pour générer et sélectionner des mutants favorables d'enzymes régénérant le NADH a été explorée.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04513625 , version 1 (20-03-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04513625 , version 1

Citer

Marion Schulz. Towards the construction of an autotrophic Escherichia coli strain. Biotechnology. Université Paris-Saclay, 2023. English. ⟨NNT : 2023UPASL140⟩. ⟨tel-04513625⟩
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