The Dark Secrets of Fluorescent Proteins : Manipulating Fluorophore Photophysics to Boost Quantitative SMLM
Les secrets obscurs des protéines fluorescentes : manipulation de la photophysique des fluorophores pour améliorer la SMLM quantitative
Résumé
Fluorescence single-molecule localization microscopy (SMLM) has become an indispensable tool in integrated structural and cell biology, providing insights into macromolecular organizations and dynamics at the nanoscale in cellulo. A popular SMLM technique is photoactivated localization microscopy (PALM), which relies on the ‘smart’ photophysical behavior of phototransformable fluorescent proteins (PTFPs). Yet, the complex photophysical behaviors of PTFPs hinder quantitative PALM applications, such as counting (qPALM) and single-particle tracking (sptPALM). Besides suboptimal fluorophore behaviors, imaging artifacts and the necessity for sophisticated data analysis contribute to the still limited usage of quantitative PALM techniques. Aiming to push the application of quantitative PALM, my PhD work consists of two projects, dealing with different aspects of quantitative PALM.The first project is focused on the characterization of PTFPs, aiming to develop strategies to improve their behavior for SMLM. This work starts with a comparison between different protein immobilization platforms for the photophysical characterization of PTFPs. Next, follows an investigation of the effects of different illumination conditions on the behavior of the popular green-to-red photoconvertible FP mEos4b, using a combination of single-molecule and ensemble fluorescence microscopy and simulations. Lastly, my thesis contributes to the development of a new photophysical model describing the behavior of the reversibly photoswitchable FP rsEGFP2 at cryogenic temperature. Altogether, this work contributes to a deeper understanding of the photophysical behavior of PTFPs and provides guidelines for optimized imaging schemes for PALM imaging.The second project involves the application of sptPALM to study stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans, one of the most radioresistant bacterium known today. By monitoring the diffusion dynamics of the mEos4b labeled nucleoid associated protein HU, this work reveals that nucleoid remodeling proceeds differently in response to different stresses. Using simulations, it discusses how the small size of bacteria complicates the interpretation of sptPALM data. The work highlights the value of sptPALM for the study of bacteria but also identifies weaknesses in current analysis pipelines that may lead to erroneous data interpretation.
La microscopie de localisation à molécule unique par fluorescence (SMLM) est devenue un outil indispensable en biologie structurale et cellulaire intégrée, permettant de mieux comprendre les organisations et dynamiques macromoléculaires à l'échelle nanométrique in cellulo. La microscopie de localisation photoactivée (PALM), qui repose sur le comportement photophysique "intelligent" des protéines fluorescentes phototransformables (PTFP), est une technique SMLM très répandue. Cependant, les comportements photophysiques complexes des PTFP entravent les applications quantitatives de la PALM, telles que le comptage (qPALM) et le suivi d'une seule particule (sptPALM). Outre les comportements suboptimaux des fluorophores, les artefacts d'imagerie et la nécessité d'une analyse sophistiquée des données contribuent à l'utilisation encore limitée des techniques PALM quantitatives. Dans le but d'étendre l'application de la technique PALM quantitative, mon travail de doctorat consiste en deux projets, qui traitent de différents aspects de la technique PALM quantitative.Le premier projet est axé sur la caractérisation des PTFP, dans le but de développer des stratégies visant à améliorer leur comportement pour SMLM. Ce travail commence par une comparaison entre différentes plateformes d'immobilisation des protéines pour la caractérisation photophysique des PTFP. Ensuite, nous étudions les effets de différentes conditions d'illumination sur le comportement du populaire FP photoconvertible vert-rouge mEos4b, en utilisant une combinaison de microscopie de fluorescence à molécule unique et d'ensemble, ainsi que des simulations. Enfin, ma thèse contribue au développement d'un nouveau modèle photophysique décrivant le comportement du FP réversiblement photoswitchable rsEGFP2 à température cryogénique. Dans l'ensemble, ce travail contribue à une meilleure compréhension du comportement photophysique des PTFPs et fournit des lignes directrices pour des schémas d'imagerie optimisés pour l'imagerie PALM.Le second projet concerne l'application de sptPALM pour étudier le remodelage des nucléoïdes induit par le stress chez Deinococcus radiodurans, l'une des bactéries les plus radiorésistantes connues à ce jour. En surveillant la dynamique de diffusion de la protéine HU associée au nucléoïde et marquée au mEos4b, ce travail révèle que le remodelage du nucléoïde se déroule différemment en réponse à différents stress. À l'aide de simulations, il montre comment la petite taille des bactéries complique l'interprétation des données sptPALM. Ce travail met en évidence la valeur de sptPALM pour l'étude des bactéries, mais identifie également les faiblesses des pipelines d'analyse actuels qui peuvent conduire à une interprétation erronée des données.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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