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Thèse Année : 2023

Engineering 3D Microenvironments to Generate Functional Pre-Vascularized Human Beige Adipose Tissue Constructs : Form ex vivo organoid model to transplantable micro-tissue

Ingénierie de micro-environnements 3D pour la génération de tissus adipeux beiges humains fonctionnels et pré-vascularisés : du modèle organoïde ex vivo au micro-tissu transplantable

Mélanie Escudero
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1411848
  • IdRef : 28002083X

Résumé

Cells in tissues and organs are organized within complex 3D environments surrounded by neighboring cells, extracellular matrices, and dynamic chemical gradients. Advancing methods to develop relevant 3D models of functional human adult tissue represents a pivotal challenge in Biosciences. These tissue constructs serve as enhanced models to advance basic science or to screen therapeutic targets as well as advanced therapy medicinal products to favor tissue regeneration or to support organ with defective function. In this thesis, we aimed to engineer defined 3D microenvironment to generate multi-purposes 3D adult tissue models. We specifically focused on human beige adipose tissues (AT). Due to their unique properties in energy dissipation, increasing beige AT activity by pharmacotherapy or cell-based transplantations holds therapeutic promises to face obesity and diabetes pandemics. However, in vitro 3D relevant models of human beige AT are currently lacking which hinder research into these tissues and biotherapy development. During this thesis, we developed an innovative method to generate functional and vascularized beige adipose organoids using human stromal vascular fraction (SVF) of white adipose tissue as a source of adipose derived stromal cells (ASC) and endothelial progenitors. We engineered defined chemical and biomechanical environment, applicable at multiple tissue scales, to drive self-organization of spheroids. Embedding of spheroids in GelMA hydrogel was used to promote cell viability and cell organization. GelMA volume and GelMA percentage were optimized to favor cell colonization and cell viability. Translating from 2D to 3D culture, inhibition of TGFbeta pathway was also key to promote beige adipogenesis while maintain vascular formation from amplified SVF cells-spheroids. Combination of GelMA environment and beige adipogenic medium promoted generation of beige adipose organoids containing beige adipocyte and vascular compartment mirroring native tissue architecture from both amplified and fresh SVF cells. These organoids display key features of native beige AT including inducible UCP1 expression, increased uncoupled mitochondrial respiration and batokines secretion. To scale up beige adipose organoid generation toward micro-tissue, we developed GelMA molding and spheroid patterning to replicate environment specified at the individual spheroid level within a multi-spheroid setting. This led to the generation of beige adipose micro-tissue containing embedded vasculature without hindering beige adipocyte differentiation level and cell viability. Preliminary transplantation assays of these microtissue in healthy NSG mice showed efficient integration of human vessels in host vasculature with promising maintenance of human cell viability. Finally, we also explored technological approaches to generate cell culture system allowing for a better examination of how microenvironment parameters drive cell organization in 3D matrices. Our approach represents significant advances in developing in vitro human beige AT models and facilitates broad applications ranging from basic research to biotherapies. Given multipotency of ASC and tunability of GelMA hydrogels, this engineering method could be transposable to other tissues highlighting the potential of this system to address essential aspects of tissue generation beyond adipose tissue.
Au sein des tissus, les cellules s'organisent dans des microenvironnements 3D complexes, composés de leurs cellules voisines, de contraintes physiques en grande partie générées par la matrice extracellulaire et de gradients chimiques dynamiques. Développer des modèles 3D fonctionnels de tissus adultes humains représente un défi important dans le domaine des biosciences en tant que modèles ex vivo pertinents permettant le progrès de la recherche fondamentale et le criblage de molécules mais aussi en tant qu'objet thérapeutique transplantable pour de futures biothérapies. L'objectif de cette thèse s'inscrit dans ce contexte et a eu pour premier objectif de définir un microenvironnement 3D permettant la génération de modèles 3D polyvalents de tissus adipeux (TA) beiges humains. En effet, l'augmentation de leur activité par pharmacothérapie ou greffes cellulaires représente une approche thérapeutique prometteuse pour faire face à la montée de l'obésité et du diabète. Cependant, les modèles in vitro de TA beige humain sont rares, ce qui entrave la recherche sur ces tissus et le développement de biothérapies. Au cours de cette thèse, nous avons développé une approche d'ingénierie innovante qui permet la génération d'organoïdes adipeux beiges fonctionnels et vascularisés dérivés de la fraction vasculaire stromale humaine (SVF) de tissu adipeux blanc. Nous avons défini un environnement chimique et biomécanique précis, applicable à différentes échelles, pour guider l'auto-organisation de sphéroïdes vers l'émergence d'organoïde fonctionnel. L'encapsulation des sphéroïdes dans un hydrogel dérivé de gélatine, le GelMA, a été utilisée pour favoriser le maintien et l'organisation cellulaire. Le volume et le pourcentage de GelMA ont été optimisés pour favoriser la colonisation et la viabilité des cellules. L'inhibition de la voie TGFbeta s'est avérée essentielle dans les cultures 3D afin de favoriser l'abiogenèse beige et la formation vasculaire. La combinaison de l'environnement biomécanique de GelMA et biochimique du milieu de différentiation a permis la génération d'organoïdes adipeux beiges vascularisés mimant l'architecture des tissus natifs à partir de cellules de SVF amplifiées ou fraîchement isolées. Ces organoïdes présentent des caractéristiques clés des TA beiges natifs, notamment l'expression inductible d'UCP1, une augmentation de la respiration mitochondriale découplée et la sécrétion de batokines. La transposition de l'environnement spécifié au niveau d'un sphéroïde à un contexte multi-sphéroïdes a conduit à la génération de micro-tissus adipeux beige vascularisé sans modifier la viabilité cellulaire et la différentiation adipocytaire. Des premiers essais de transplantation de ces micro-tissus dans des souris NSG saines ont montré une intégration efficace des vaisseaux humains néoformés dans la vascularisation murine associée à un maintien prometteur de la viabilité des cellules humaines. Par ailleurs, nous avons commencé à explorer des solutions technologiques pouvant permettre d'examiner plus précisément l'influence des paramètres du microenvironnement sur l'organisation cellulaire au sein de matrices 3D. Notre approche constitue une avancée majeure dans la création de modèles 3D de tissu adipeux beige humain in vitro qui n'existait pas à l'heure actuelle, permettant une variété d'applications allant de la recherche fondamentale aux biothérapies. Compte tenu de la multipotence des ASC et du caractère modulable des hydrogels de GelMA, cette méthode d'ingénierie pourrait être transposée à d'autres tissus, démontrant le potentiel de ce système pour aborder des aspects essentiels de la génération de tissus au-delà du tissu adipeux.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04685321 , version 1 (03-09-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04685321 , version 1

Citer

Mélanie Escudero. Engineering 3D Microenvironments to Generate Functional Pre-Vascularized Human Beige Adipose Tissue Constructs : Form ex vivo organoid model to transplantable micro-tissue. Human health and pathology. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2023. English. ⟨NNT : 2023TOU30391⟩. ⟨tel-04685321⟩
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