Structural insight into photobleaching mechanisms of reversible photoswitchable fluorescent proteins
Etude structurale des mécanismes de photoblanchiment des protéines fluorescentes photocommutables
Résumé
The discovery of phototransformable FPs (PTFPs) from Anthozoa species, thanks to
their photophysical properties, has opened a large field in biological fluorescence imaging.
One of the PTFPs’ sub-groups consists of Reversible Photoswitchable Fluorescent Proteins
(RSFPs), which can be reversibly switched between nonfluorescent and fluorescent states.
Photobleaching is the permanent loss of the fluorescence-emitting capacity under excitation,
which is a common phenomenon among all the fluorescent molecules. Photobleaching has a
large impact on the microscopy image quality, notably on super-resolution imaging.
Photoswitchable fluorescent proteins have a tendency to lose performance within every
switching cycle, a process referred to as “photofatigue”. Our interest of study is focused on
the photobleaching mechanisms of RSFPs.
We have reported the crystallographic structure of photobleached IrisFP under high
and low illumination intensity at room temperature as well as its spectroscopic modifications.
We found that different illumination intensities can result in different photobleaching
pathways. Under low illumination intensity, an oxygen-dependent photobleaching pathway
was evidenced. Structural modifications induced by singlet-oxygen production within the
chromophore pocket revealed the oxidation of two sulfur-containing residues, Met159 and
Cys171, locking the chromophore in a nonfluorescent protonated state. Under high
illumination intensity, a completely different, oxygen-independent photobleaching pathway
was found. The conserved Glu212 underwent decarboxylation concomitantly with an
extensive rearrangement of the H-bond network around the chromophore, and an sp2-to-sp3
hybridization change of the carbon atom bridging the chromophore cyclic moieties was
observed. As Met159 is the key residue involved in low-intensity illumination photobleaching,
we have then mutated Met159 into Alanine in order to avoid sulfoxidation. We found that the
IrisFP-M159A mutant display an enhanced photostability in solution, in PVA gel and in
E.coli cells.
La découverte des Protéines Fluorescentes Phototransformables (PTFPs) issues
d’espèces anthozoaires a ouvert, grâce à leurs propriétés photophysiques particulières, un
vaste champ d’investigation pour l'imagerie biologique de fluorescence. L'un des sousgroupes
des PTFPs est formé des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables
(RSFPs), qui peuvent être commutées réversiblement entre des états non-fluorescent et
fluorescent. Le photoblanchiment est la perte définitive d’émission de fluorescence sous
excitation et est un phénomène commun à toutes les molécules fluorescentes. Le
photoblanchiment a un impact important sur la qualité des images de microscopie, notamment
en imagerie de super-résolution. Les RSFPs ont tendance à perdre de leur performance à
chaque cycle de commutation, un processus dénommé “photofatigue”. Notre intérêt est centré
sur l'étude des mécanismes de photofatigue des RSFPs.
Nous avons rapporté les structures cristallographiques d’IrisFP photoblanchie par une
forte et une basse intensité d’illumination à température ambiante ainsi que les modifications
spectroscopiques associées. Nos résultats démontrent que différentes intensités d'excitation
peuvent donner lieu à différentes voies de photoblanchiment. Sous faible intensité d'excitation,
une voie de photoblanchiment dépendante de l'oxygène a été mise en évidence. Les
modifications structurales induites par la production d'oxygène singulet à l'intérieur de la
poche du chromophore ont révélé l'oxydation de deux résidus soufrés, Met159 et Cys171,
piégeant le chromophore dans un état protoné non-fluorescent. Sous haute intensité
d'excitation, une voie de photoblanchiment oxygène-indépendante totalement différente a été
trouvée. Le Glu212, strictement conservé, subit une décarboxylation associée à un important
réarrangement du réseau de liaisons hydrogènes autour du chromophore, et un changement
d’hybridation sp2 vers sp3 du carbone reliant les cycles du chromophore est observé. En tant
que résidu clé impliqué dans le photoblanchiment induit par faible intensité d'excitation, nous
avons muté Met159 en alanine afin d'éviter une sulfoxydation. Nous avons trouvé que le
mutant IrisFP-M159A démontre une photostabilité améliorée en solution, en gel PVA et dans
des cellules E. coli.
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